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Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05
线粒体内单线态氧荧光探针试剂
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C35H37ClN2Si

分子量:

549.22

特点:

 

● 能够对活细胞进行荧光成像

● 对单线态氧的高选择性

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选择规格:
2μg

现货

 
线粒体检测方案

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

产品概述
原理
荧光特性
反应特异性
实验例
常见问题Q&A
参考文献

产品概述

       单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧(ROS),是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中,去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域,单线态氧在光动力疗法(PDT:一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法)中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜,所以无法用于活细胞检测。

Majima等人合成了一种由含硅罗丹明和蒽环构成的新型远红外荧光探针Si-DMA,分别作为发色团和单线态氧反应位点。当存在单线态氧时会在Si-DMA的蒽环部位生成内过氧化物,Si-DMA的荧光强度会增强1)。在7种不同活性氧中,Si-DMA能够特异性地检测单线态氧(图3)。另外在用5-氨基乙酰丙酸(5-ALA,一种血红素前体)处理细胞后,Si-DMA可以实时观察到线粒体中原卟啉IX产生单线态氧的变化情况(图4)。

原理

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图1. Si-DMA的细胞染色原理

荧光特性

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图2. Si-DMA与单线态氧反应后的激发和发射光谱

反应特异性

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图3. Si-DMA对各种ROS的选择性

实验例

实验例1  荧光显微镜观察用5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA) 处理后的HeLa细胞中的单线态氧

1. 接种200 μl HeLa细胞 (2.4×105 cells/ml) 在μ-slide 8孔板 (ibidi) ,培养基为DMEM (10%FBS,1%青霉素-链霉素),

在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。

2. 用200 μl Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

3. 在μ-slide 8孔板中加入200 μl 含5-ALA的Hanks’ HEPES 缓冲液 (150 μg/ml),在37℃ 5% CO2培养箱中培养4 h。

4. 用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

5. 加入200 μl Si-DMA工作液(40 nmol/l), 在37℃ 5% CO2培养箱中培养45 min。

6. 用200 μl Hanks’ HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

7. 加入200 μl Hanks’ HEPES缓冲液,并用荧光显微镜进行观察。

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA检测5-ALA处理的HeLa细胞线粒体中的单线态氧的荧光成像

5-ALA处理过的HeLa细胞经过2.5 min照射后,Si-DMA的荧光增强,因此Si-DMA可以用于实时监测线粒体中原卟啉IX产生的单线态氧。

滤镜 (波长/带通型滤光片)

荧光成像:600±25 nm (Ex), 685±25 nm (Em)

实验例2  线粒体中的单线态氧检测 

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

用终浓度为50 μmol/l的过氧化氢和终浓度为50 μmol/l的次氯酸刺激或不刺激HeLa细胞,用Si-DMA检测到细胞中产生的单线态氧。和线粒体染料(MitoBright Green: MT06)共染,特异性地在线粒体中检测到了单线态氧。

波长(激发波长/发射波长)

Si-DMA: 600±25 nm/685±25 nm

MitoBright Green: 488 nm/501-563 nm

实验例3  观察用H2O2处理Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA检测用H2O2刺激Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧荧光成像

实验条件:

用10 mM H2O2刺激Primary Hepatocytes 20 min。

细胞数量:1×104/dish

容器:Nest 15 mm共聚焦培养皿801002

染色条件:在37℃ 5% CO2培养箱中染色45 min

Si-DMA工作液浓度:100 nmol/l

检测仪器:激光共聚焦显微镜

仪器品牌:Leica,Cambridge, UK

仪器型号:BMI-6000

Ex:600 nm,Em: 685 nm

(以上数据由东方肝胆外科医院信号转导实验室友情提供)

常见问题Q&A

Q1、本试剂盒与现有方法相比有什么优势?
A1:本试剂盒的优点是“能够对活细胞进行荧光成像”和“对单线态氧的高选择性”。在操作说明中有详细的实验数据。
Q2、DMSO Stock Solution的稳定性怎么样?
A2:DMSO Stock Solution配制后在-20℃及避光条件下可以保存大约1个月,建议根据每次的用量进行分装保存。
Q3、配制Working Solution可以用Hanks’ HEPES以外的缓冲液吗?
A3:还可以用HBSS缓冲液。
Q4、Working Solution的稳定性怎么样?
A4:Working Solution不稳定,请在配制当天使用。

参考文献

1、S. Kim, T. Tachikawa, M. Fujitsuka, T. Majima, “Far-Red Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during Photodyanamic Therapy”, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (33), 11707.

2、S. Bekeschus, A. Mueller, U. Gaipl, KD. Weltmann, “Physical plasma elicits immunogenic cancer cell death and mitochondrial singlet oxygen”, TRPMS., 2017, 99, DOI:10.1109/TRPMS.2017.2766027.

3、Y. D. Riani, T. Matsuda, K. Takemoto and T. Nagai, “Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation “, BMC Biol, 2018, 16, 50.

4、T. Guo, T. Liu, Y. Sun, X. Liu, R. Xiong, H. Li, Z. Li, Z. Zhang, Z. Tian, and Y. Tian, “Sonodynamic therapy inhibits palmitateinduced beta cell dysfunction via PINK1/ Parkin-dependent mitophagy”, Cell Death Dis., 2019, 10, 457.

5、K. Murotomi, A. Umeno, S, Sugino and Y. Yoshida. , “Quantitative kinetics of intracellular singlet oxygen generation using a fluorescence probe”, Sci Rep, 2020, 10, 10616.

6、Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”, 2022, doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

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如何选择正确的参考材料质量等级

如何选择正确的参考材料质量等级

质量等级、分析证书和计量可追溯性及其对您的意义

谁使用参考资料?

标准物质是分析测试工作流程的关键组成部分。通过测量系统的校准、方法的验证和质量控制程序,参考材料可确保测试的准确性。从有证标准物质 (CRM) 和其他质量等级的标准物质,到分析证书、计量可追溯性和其他概念,标准物质的世界非常广阔,有时甚至令人困惑。 

参考材料的计量溯源性和 SI 单位

计量溯源性是标准物质领域的一个重要概念。计量溯源性中的一个基本术语是 SI 测量单位。国际单位制 (SI) 将七种测量单位定义为可以派生所有其他 SI 单位的基本集合。用于参考物质可追溯性的两个最常见的 SI 测量单位是千克和摩尔。

计量可追溯性意味着可以对不同地点、不同时间、不同人员使用不同设备进行的测量进行有意义的比较。测量结果必须通过记录的、不间断的校准链与参考相关联,追溯到 SI 测量单位

国家计量标准(例如 NIST、JRC、NMI Australia)
药典标准(例如 USP、EP、BP、JP、IP)

  • 由机构签发

  • 被认为提供高水平的准确性和可追溯性

认证标准物质 (CRM)(ISO 17034、17025)

  • 被认为能够为 SI 测量单位提供高水平的准确性、不确定性和可追溯性

  • 由经认可的参考材料生产商制造

参考材料 (RM) (ISO 17034)

  • 满足比 CRM 要求更低的 ISO 要求

  • 由经认可的参考材料生产商制造

分析标准(ISO 9001)

  • 提供分析证书

  • 认证级别各不相同

试剂级/研究化学品

  • 可能附带分析证书

  • 不适合用作参考材料


标准物质层次结构包括五个主要质量等级,从国家计量和其他主要标准到认证标准物质 (CRM)、标准物质 (RM)、分析标准品以及研究级或研究化学品。每个更高级别的认证级别和可追溯性要求都会增加。当国家政府向最高层提供标准化时,具体的 ISO 指南则为 CRM 和 RM 提供标准化。这些 ISO 要求包括 ISO 17034、ISO/IEC 17025 和 ISO Guide 31。

标准物质生产商必须满足这些 ISO 要求才能制造 CRM 或 RM。对于这两个质量等级,必须提供分析证书,并且其中包含的信息由上述 ISO 指南定义。最后两个级别的质量规格由每个生产商定义,而不是由国家政府或特定于 CRM 和 RM 的 ISO 认证定义。

每个等级的参考材料测量什么?

材料的纯度和特性通常包含在五个质量等级中每个等级的分析证书中。主要标准或 ISO 定义的 CRM 和 RM 需要内容和稳定性。

分析标准品和研究化学品可能包括也可能不包括这两个参数,因为它们的包含取决于生产商。在某些情况下,分析标准品也可以是符合 ISO 指南 80 的质量控制材料。

初级标准、CRM 和 RM 要求具有同质性,但较低质量等级不会出现此参数。不确定性和可追溯性信息仅限于主要标准和 CRM。在制药领域,二级标准可以是 CRM 或 RM,但这里有两种不同类型的可追溯性 – ISO 定义的 CRM 的 SI 测量单位以及对主要药典标准的可追溯性,这是一项要求具体到药品二级标准。