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同仁化学Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1| 日本DOJINDO

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Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306
6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester
CAS号：89889-52-1
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C26H41NO7S

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567.7

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蛋白质抗体标记检测方案

Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

试剂盒内含
规格性状
产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

10 mg    Biotin-(AC5)2-Osu

规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：90.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

红外光谱：测试合格

NMR谱：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

如果有机溶剂不能用于蛋白质的氨基标记，则可以使用带有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的抗生蛋白链菌素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

操作步骤

产品使用步骤:

  1. 参照下表配制50mmol/l的生物素标记试剂溶液：Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

由于生物素标记试剂遇水易分解，所以需要现配现用。

2. 蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

3. 标记蛋白质的凝胶过滤及纯化。

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

常见问题Q&A

 

 

Q1:氨基标记有两种类型，OSu和Sulfo-OSu。 它们有何不同？
 

 

A:反应性几乎相同。由于磺基-OSu型具有磺酸基，因此它在水中的溶解度很高，并且可以在高浓度下反应。当您不想向系统中添加有机溶剂（例如DMSO）时，它也很有效。另一方面，在储存过程中它容易吸收水分并容易水解。
 

Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
 

A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。

参考文献

1) P. Kongtawelert and P. Ghosh, ” A New Sandwich-ELISA Method for the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids Employing a Monoclonal Antibody and Labelled Avidin Biotin Technique.”, Clin. Chem. Acta,, 1990, 195, 17.

2) G. Paganelli, S. Pervez, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassllati and A. A. Epenetos, “Intraperitoneal Radio-localization of Tumors Pre-targeted by Biotinylated Monoclonal Antibodies”, Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.

3) C. Wagener, U. Kruger and J. E. Shively, “Selective Precipitation of Biotin-labeled Antigens or Monoclonal Antibodies by Avidin for Determining Epitope Specificities and Affinities in Solution-phase Assays”, Methods Enzymol., 1990, 184, 518.

4) D. M. Boorsma, J. Van Bommel and E. M. Vander Raaij-Helmer, “Simultaneous Immunoenzyme Double Labelling Using Two Different Enzymes Linked Directly to Monoclonal Antibodies or with Biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.

5) A. Komura, T. Tokuhisa, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone and Y. Mishima, “Specific Killing of Human Melanoma Cells with an Efficient 10B-compound on Monoclonal Antibodies”, Pigment Cell Res., 1989, 2, 259.

6) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli and P. Neri, “Competitive Enzyme Immunoassay for Human Chorionic Somatomammotropin Using the Avidin-biotin System”, Anal. Biochem., 1981, 118, 168.

同仁化学Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2| 日本DOJINDO

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Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305
6-(Biotinylamino)hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester
CAS号：72040-63-2
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Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

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产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

10 mg      Biotin-AC5-Osu

规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：95.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

如果有机溶剂不能用于蛋白质的氨基标记，则可以使用带有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的抗生蛋白链菌素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

操作步骤

产品使用步骤:

1.参照下表配制50mmol/l的生物素标记试剂溶液：

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

由于生物素标记试剂遇水易分解，所以需要现配现用。

2.蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

3.标记蛋白质的凝胶过滤及纯化。

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

常见问题Q&A

 

Q1:氨基标记有两种类型，OSu和Sulfo-OSu。 它们有何不同？
 

A:反应性几乎相同。由于磺基-OSu型具有磺酸基，因此它在水中的溶解度很高，并且可以在高浓度下反应。当您不想向系统中添加有机溶剂（例如DMSO）时，它也很有效。另一方面，在储存过程中它容易吸收水分并容易水解。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。

参考文献

1) P. Kongtawelert and P. Ghosh, ” A New Sandwich-ELISA Method for the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids Employing a Monoclonal Antibody and Labelled Avidin Biotin Technique.”, Clin. Chem. Acta,, 1990, 195, 17.

2) G. Paganelli, S. Pervez, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassllati and A. A. Epenetos, “Intraperitoneal Radio-localization of Tumors Pre-targeted by Biotinylated Monoclonal Antibodies”, Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.

3) C. Wagener, U. Kruger and J. E. Shively, “Selective Precipitation of Biotin-labeled Antigens or Monoclonal Antibodies by Avidin for Determining Epitope Specificities and Affinities in Solution-phase Assays”, Methods Enzymol., 1990, 184, 518.

4) D. M. Boorsma, J. Van Bommel and E. M. Vander Raaij-Helmer, “Simultaneous Immunoenzyme Double Labelling Using Two Different Enzymes Linked Directly to Monoclonal Antibodies or with Biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.

5) A. Komura, T. Tokuhisa, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone and Y. Mishima, “Specific Killing of Human Melanoma Cells with an Efficient 10B-compound on Monoclonal Antibodies”, Pigment Cell Res., 1989, 2, 259.

6) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli and P. Neri, “Competitive Enzyme Immunoassay for Human Chorionic Somatomammotropin Using the Avidin-biotin System”, Anal. Biochem., 1981, 118, 168.

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Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01
生物素标记抗体试剂
Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)
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储存条件：0-5度保存
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1set

期货

 
蛋白质抗体标记检测方案

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

试剂盒内含
产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

产品概述

水溶性活性酯型生物素化试剂：使用生物素（AC5）2Sulfo-OSu用于生物素标记蛋白质游离氨基的试剂盒。它带有用于标记的LVDS3缓冲粉，用于凝胶过滤的柱和用于柱洗脱的PBS片剂，可以纯化标记的蛋白。由于是单次注射型（10毫克x4瓶），因此可以标记4种不同类型的蛋白质。可以通过改变添加的生物素-（AC5）2 Sulfo-OSu的量来控制标记率。

*标记蛋白的量为1-5 mg。

原理

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

操作步骤

使用注意事项:

1. 本试剂盒请在0-5 ℃储存。

2. Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液需要现配现用 (由于Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu易水解，尽量避免在水溶液的状态保存)。

3. 标记好的蛋白质请在0-5 ℃保存 (加入0.1%的叠氮钠等防腐剂)。

使用步骤:

1. 配制溶液

1) NaHCO3缓冲液

在含有NaHCO3粉末的容器中加入10ml超纯水溶解。

2) PBS缓冲液

在100ml容量瓶中加入1片PBS，先用少量超纯水溶解后，再用超纯水补充至100ml，制成10mmol/l的PBS缓冲液。

3) 蛋白质溶液

在样品管中精确称量1.0-5.0mg蛋白质并记录称量值后，用移液器加入500μl操作步骤1)中的NaHCO3缓冲液。盖上盖子后，用漩涡振荡器等搅拌溶解蛋白质。

4) Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液

在1支含有Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu的管子中加入适量纯水溶解。为了控制标记率，根据不同的标记对象，请参考表1调整Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液的浓度及加入量。

＊由于Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu易水解，溶解后请尽快标记。

2. 生物素标记操作方法

1) 请参考表1在配制好的蛋白质溶液中加入合适浓度和用量的Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液。

2) 盖紧盖子充分混合后，在25 ℃水浴恒温摇床中培养2h。

表1 Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu标记各种蛋白质的标记率

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

以上数据为本公司实际检测的结果，如实验条件变动，

结果有可能改变。标记率是根据HABA法测得。

a) 1mol蛋白质：生物素的摩尔数

b) 1mol蛋白质上所结合的生物素的摩尔数

3. 蛋白质标记后的凝胶过滤纯化

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

＊经过层析，生物素标记蛋白质的最终浓度为标记时的1/2。

按照下列公式计算生物素标记蛋白质的最终浓度：

A (mol/l) = (X/MWprotein) × (1,000/Y) × 0.5

X：蛋白质的重量

MWprotein：蛋白质的分子量

Y：溶解蛋白质的NaHCO3缓冲液体积

常见问题Q&A

Q1:如何存储标记的蛋白质？
A:将标记的蛋白质存放在冰箱中。另外，添加0.1％叠氮化钠作为防腐剂。
Q2:生物素标记试剂在水溶液中稳定吗？
A:试剂盒中使用的生物素-（AC5）2 Slufo-OSu处于水溶液中时，由于它会水解，因此无法存储在水溶液中。使用前请做好准备。另外，即使在粉末状态下，也要注意由于吸湿引起的劣化。

参考文献

1) J.   Wormmeester, F. Stiekema and C. Groot, “Immunoselective Cell Separation”, Methods Enzymol., 1990, 184, 314.
2) J. J. Leary and D. J.   Ward, “Rapid and Sensitive Colorimetric Method for Visualizing   Biotin-labeled DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Immoilized on   Nitrocelulose: Bio-blots”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 4045.
3) W. T. Lee and D. H.   Conrad, “The Murine Lymphocyte Receptor for IgE II. Characterization of   the Multvalent Nature of the B Lymphocyte Receptor for IgE”, J. Exp.   Med., 1984, 159, 1790.
4) D. R. Gretch, M. Suter and   M. F. Stinski, “The Use of Biotinylated Monoclonal Antibodies and   Streptavidin Affinity Chromatography to Isolate Herpesvirus Hydorophobic   Proteins or Glycoproteins”, Anal. Biochem., 1987, 163, 270.
5) M. Shimkus, J. Levy and T.   Herman, “A Chemically Cleavable Biotinylated Nucleotide: Usefulness in   the Recovery of Protein-DNA Complexes from Avidin Affinity Columns”,   Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2593.
6) W. J. LaRochelle and S. C.   Froehner, “Immunodhemical Detection of Proteins Biotinylated on   Nitrocellulose Replicas”, J. Immunol. Methods, 1986, 92, 65.
7) P. S. Anjaneyulu and J. V.   Staros,”Reactions of N-hydroxysulfosuccinimide Active Esters”, Int.   J. Pept. Protein Res., 1987, 30, 117.
8) H. M. Ingalls, C. M.   Goodloe-Holland and E. J. Luna,”Junctional Plasma Membrane Domains   Isolated from Aggregating Dictyostelium Discoideum Amebae”, Proc. Natl.   Acad. Sci. USA, 1986, 83, 4779.
9) J. Guesdon, T. Ternyck and   S. Avrameas,”The Use of Avidin-Biotin Interaction in Immunoenzymatic   Techniques”, J. Histochem. Cytochem., 1979, 27, 1131.

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6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester
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规格性状
产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

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10 mg    Biotin-(AC5)2-Osu

规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：90.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

红外光谱：测试合格

NMR谱：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

如果有机溶剂不能用于蛋白质的氨基标记，则可以使用带有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的抗生蛋白链菌素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

操作步骤

产品使用步骤:

  1. 参照下表配制50mmol/l的生物素标记试剂溶液：Biotin-(AC5)2-Osu试剂货号：B306 CAS号：89889-52-1

由于生物素标记试剂遇水易分解，所以需要现配现用。

2. 蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

3. 标记蛋白质的凝胶过滤及纯化。

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

常见问题Q&A

 

 

Q1:氨基标记有两种类型，OSu和Sulfo-OSu。 它们有何不同？
 

 

A:反应性几乎相同。由于磺基-OSu型具有磺酸基，因此它在水中的溶解度很高，并且可以在高浓度下反应。当您不想向系统中添加有机溶剂（例如DMSO）时，它也很有效。另一方面，在储存过程中它容易吸收水分并容易水解。
 

Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
 

A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。

参考文献

1) P. Kongtawelert and P. Ghosh, ” A New Sandwich-ELISA Method for the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids Employing a Monoclonal Antibody and Labelled Avidin Biotin Technique.”, Clin. Chem. Acta,, 1990, 195, 17.

2) G. Paganelli, S. Pervez, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassllati and A. A. Epenetos, “Intraperitoneal Radio-localization of Tumors Pre-targeted by Biotinylated Monoclonal Antibodies”, Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.

3) C. Wagener, U. Kruger and J. E. Shively, “Selective Precipitation of Biotin-labeled Antigens or Monoclonal Antibodies by Avidin for Determining Epitope Specificities and Affinities in Solution-phase Assays”, Methods Enzymol., 1990, 184, 518.

4) D. M. Boorsma, J. Van Bommel and E. M. Vander Raaij-Helmer, “Simultaneous Immunoenzyme Double Labelling Using Two Different Enzymes Linked Directly to Monoclonal Antibodies or with Biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.

5) A. Komura, T. Tokuhisa, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone and Y. Mishima, “Specific Killing of Human Melanoma Cells with an Efficient 10B-compound on Monoclonal Antibodies”, Pigment Cell Res., 1989, 2, 259.

6) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli and P. Neri, “Competitive Enzyme Immunoassay for Human Chorionic Somatomammotropin Using the Avidin-biotin System”, Anal. Biochem., 1981, 118, 168.

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Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305
6-(Biotinylamino)hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester
CAS号：72040-63-2
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：室温

分子式：

C20H30N4O6S

分子量：

454.54

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10mg

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蛋白抗体标记检测方案

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

试剂盒内含
规格性状
产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

10 mg      Biotin-AC5-Osu

规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：95.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

如果有机溶剂不能用于蛋白质的氨基标记，则可以使用带有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的抗生蛋白链菌素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

操作步骤

产品使用步骤:

1.参照下表配制50mmol/l的生物素标记试剂溶液：

Biotin-AC5-Osu试剂货号：B305 CAS号：72040-63-2

由于生物素标记试剂遇水易分解，所以需要现配现用。

2.蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

3.标记蛋白质的凝胶过滤及纯化。

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

常见问题Q&A

 

Q1:氨基标记有两种类型，OSu和Sulfo-OSu。 它们有何不同？
 

A:反应性几乎相同。由于磺基-OSu型具有磺酸基，因此它在水中的溶解度很高，并且可以在高浓度下反应。当您不想向系统中添加有机溶剂（例如DMSO）时，它也很有效。另一方面，在储存过程中它容易吸收水分并容易水解。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。

参考文献

1) P. Kongtawelert and P. Ghosh, ” A New Sandwich-ELISA Method for the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids Employing a Monoclonal Antibody and Labelled Avidin Biotin Technique.”, Clin. Chem. Acta,, 1990, 195, 17.

2) G. Paganelli, S. Pervez, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassllati and A. A. Epenetos, “Intraperitoneal Radio-localization of Tumors Pre-targeted by Biotinylated Monoclonal Antibodies”, Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.

3) C. Wagener, U. Kruger and J. E. Shively, “Selective Precipitation of Biotin-labeled Antigens or Monoclonal Antibodies by Avidin for Determining Epitope Specificities and Affinities in Solution-phase Assays”, Methods Enzymol., 1990, 184, 518.

4) D. M. Boorsma, J. Van Bommel and E. M. Vander Raaij-Helmer, “Simultaneous Immunoenzyme Double Labelling Using Two Different Enzymes Linked Directly to Monoclonal Antibodies or with Biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.

5) A. Komura, T. Tokuhisa, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone and Y. Mishima, “Specific Killing of Human Melanoma Cells with an Efficient 10B-compound on Monoclonal Antibodies”, Pigment Cell Res., 1989, 2, 259.

6) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli and P. Neri, “Competitive Enzyme Immunoassay for Human Chorionic Somatomammotropin Using the Avidin-biotin System”, Anal. Biochem., 1981, 118, 168.