人类神经丝轻链 (NF-L) ELISA简介

Tribioscience 的快速人类神经丝轻链 (NF-L) ELISA 旨在定量检测血清、血浆和其他生物样品中的人类 NF-L 水平。主要特点是该试剂盒使用我们新颖的专有方法将样品和检测结合成一步，而不是复杂的传统方法。它使测定变得简单、容易、准确、快速。上手时间可以在2小时以内，不需要4-5小时（图1）。检测范围为 0.156 至 10 ng/mL。人 NF-L 样品的水平与使用试剂盒标准品线性获得的标准曲线平行。因此，该试剂盒可用于测定天然人NF-L蛋白的相对质量值。

典型数据

该标准曲线（R 2 =1.000）仅供演示之用。应为每组测定的样品生成标准曲线。图3是典型数据的示例。

灵敏度

人类的最小可检测剂量 (MOD) 通常为 100 pg/ml。测定内 CV 和测定间 CV 均为 ˂10%。

特异性

该检测可识别天然和重组的人类 NF-L。与其他人无交叉反应。

程序简单（图1）

简单的标准品制备

准确的标准曲线

套件内容和储存条件

未开封的试剂盒保存于2-8℃。请勿使用已过期的套件。

该试剂盒包含足够的材料，可在一块 96 孔板上运行 ELISA。

磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息

反应性HMR Hm Mk Pg

灵敏度内源性

分子量（kDa）65

来源/同种型兔免疫球蛋白G

产品使用信息

应用稀释

蛋白质印迹法1：1000

Simple Western™1:10 – 1:50

免疫沉淀1:50

免疫荧光（免疫细胞化学）1:800 – 1:3200

流式细胞仪（固定/透化）1:800 – 1:3200

贮存 含有 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 叠氮化na。储存于 –20°C。不要等分抗体。

蛋白质印迹实验方案 对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育过夜，并轻轻摇动。  注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂 从样品制备到检测，您的蛋白质印迹所需的试剂现在都在一个方便的套件中：#12957蛋白质印迹应用解决方案套件  注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。  

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：( #9808 ) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：( #12498 ) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 ( #7722 ) 或红色上样包 ( #7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH 2 O稀释至 1X。

10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050 ) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：( #12539 ) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水与 Tween ® 20 (TBST)：( #9997 ) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

脱脂奶粉：（#9999）。

封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 毫升，将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

洗涤缓冲液：( #9997 ) 1X TBST。

牛血清白蛋白 (BSA)：( #9998 )。

一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

生物素化蛋白梯检测包：( #7727 )。

蓝色预染蛋白质标记物，宽范围 (11-250 kDa)：( #59329 )。

印迹膜和纸：( #12369 ) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。

与 HRP 缀合的二抗：抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 )。

检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。

B. 蛋白质印迹 样品制备的通用方案。

通过添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞所需的时间。

从文化中吸取介质；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。

添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl，10 cm 直径板每孔 500 µl）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管中。保持在冰上。

超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。

微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。  

注：建议加载预染色分子量标记（#59329，10 µl/泳道）以验证

电转移和生物素化蛋白质梯（#7727，10 µl/泳道）以确定分子量。  

电转移至硝酸纤维素膜 ( #12369 )。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。  

I. 膜封闭

（可选）转膜后，用 25 ml TBS 室温清洗硝酸纤维素膜 5 分钟。

将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

二.一抗孵育

将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

将膜与抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 连接抗体 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育，以检测 10 ml 溶液中的生物素化蛋白质标记物室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 继续检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用指南：

在 TBST 中洗涤膜结合的 HRP（抗体偶联物） 3 次，每次 5 分钟。

通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。搅拌均匀。

将基质与膜一起孵育 1 分钟，除去多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露于 X 射线胶片。

* 避免反复接触皮肤。

fivephoton 疫荧光转移标记试剂盒

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