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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是参与糖酵解、电子转移系统和TCA循环等细胞主要代谢途径氧化还原反应的重要辅助因子。NAD以氧化型NAD⁺和还原型NADH的形式存在于细胞中。维持适当的NAD⁺和NADH水平对细胞功能至关重要。此外最近的研究表明NAD⁺水平的下降与衰老相关，NAD⁺的量被认为是衰老相关研究的一个标志。

NAD/NADH检测试剂盒可以定量细胞中NAD⁺/NADH、NADH和NAD⁺的量，并测量它们的比值。细胞内NADH水平可以通过试剂盒内含的Extraction Buffer裂解细胞并在加热后选择性地定量检测。而细胞内的NAD⁺水平则可以通过总的NAD⁺/NADH总量减去NADH量计算得到。

NAD⁺和NADH的分别检测

分别测定NAD⁺和NADH的操作步骤

*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内的NADH量。而细胞内的NAD⁺量则可以通过总NAD⁺/NADH量减去NADH量的计算得到。

在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准品。当使用超过12个样品时，您需要准备单独的微量管。

使用NAD⁺/NADH作为指标的研究

细胞中NAD⁺和NADH的量被评估为重要的代谢指标，用于了解受药物管理和基因重组影响的癌细胞和线粒体功能。最近已经明确了长寿相关的受体与NAD⁺的含量密切相关。越来越多的人将其评估为肥胖，糖尿病和细胞分化等生物学状况的标志物。

检索来源：Google Scholar

检索关键词：

NAD/NADH    :  “NAD/NADH”

线粒体             ：“NAD/NADH”Mitochondria

癌                    ：“NAD/NADH”Cancer

肥胖                 ：“NAD/NADH”Obesity

孔板检测中数据的可靠性

可以通过同时测量该试剂盒中包含的标准溶液来进行定量分析。如果样品中NAD⁺/NADH的总含量高于2 μmol/l，则可以通过稀释样品进行评估。在下面的实验中，使用细胞数相差2倍的HeLa细胞，来确定NAD⁺和NADH的数量和比率。

使用增殖培养的HeLa细胞（2.5×10⁵，5.0×10⁵个细胞），从标准曲线中得到细胞内NAD⁺和NADH的量。最终NAD⁺的量和NADH的量会随着细胞数而改变，但是即使细胞数改变，NAD⁺和NADH量的比率也不变。

经确认，将2-Deoxy-D-glucose加入到HeLa 细胞后，代谢活性发生了变化。

用乳酸检测试剂盒检测的实验例

向HeLa细胞（1×10⁶细胞）中加入2-Deoxy-D-glucose，终浓度为6 mmol/l，培养24小时后测定乳酸量和NAD⁺/NADH比。用Lactate Assay Kit-WST（货号：L256）测定上清液中乳酸含量，去除上清后用本试剂盒检测细胞中的NAD⁺/NADH比。

最终加入2-Deoxy-D-glucose抑制了细胞内糖酵解系统，并导致乳酸量的减少和NAD⁺/NADH比率的增加。

实验例：NASH诱导小鼠肝脏组织中代谢的变化

非酒精性脂肪肝炎（NASH）病变导致组织中ATP、α-酮戊二酸（α-KG），已知NAD量减少。使用从4周龄开始进行高脂肪饮食处理   （NASH诱导）的1型糖尿病模型小鼠（STAM模型）的肝脏组织α-测量了KG、NAD量。其结果，在NASH诱导后10周龄小鼠组织

非酒精性脂肪肝炎（NASH）病变导致组织中ATP、α-酮戊二酸（α-KG），已知NAD量减少。使用从4周龄开始进行高脂肪饮食处理 （NASH诱导）的1型糖尿病模型小鼠（STAM模型）的肝脏组织α-测量了KG、NAD量。其结果，在NASH诱导后10

中α-确认KG、NAD量减少。

<使用产品>

・组织内ATP:ATP Assay Kit-Luminescence（产品货号：A550）

・组织内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（产品货号：K261）

・组织内NAD:NAD/NADH Assay Kit-WST（产品货号：N509）

<実験参考文献>

ATP　 Francesco Bellanti, et al., “Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96..

α-KG   Jianjian Zhao, et al., “The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3).

Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44.

NAD   Jinhan He, et al., “Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3”, Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55.

实验例：脂肪酸转运抑制剂引起的HeLa细胞细胞内代谢的変化

脂肪酸对膜的合成等重要，细胞的增殖不可缺少。因此，用脂肪酸转运体抑制剂处理HeLa细胞，确认了阻碍脂肪酸摄取时的细胞增殖能力及细胞内代谢（葡萄糖消耗量、Lactate释放量、NAD/NADH比率）的变化。

结果显示，细胞增殖能力下降，但葡萄糖消耗量和Lactate释放量增加，细胞内NAD+/NDH比率下降，因此确认了代谢途径向解糖类转移。

＜使用产品＞

脂肪酸摄取：Fatty Acid Uptake Assay Kit (产品货号：UP07)

细胞增殖：    Cell Counting Kit-8 (产品货号：CK04)

Glucose摄取：Glucose Assay Kit-WST (产品货号：G264)

Lactate检测：Lactate Assay Kit-WST (产品货号：L256)

实验例：诱导老化引起的A549细胞的代谢移位

当细胞老化被诱导时，SA-β-除了出现gal的表达亢进和不可逆的细胞增殖停止的现象以外，DNA损伤积蓄了的老化细胞，由于线粒体功能的降低能源产生转移到解糖系。

因此，用Doxorubicin处理A549细胞，诱导老化时的SA-β-确认了gal表达亢进及能量产生途径（NAD量、线粒体膜电位、ATP量、Lactate释放量）的偏移。

结果发现DNA损伤，SA-β-刚度测量-β- Galactosidase）生产量增加，细胞内NAD+量下降，线粒体膜电位下降，能量生产途径从氧化性磷酸化转移到解糖系

＜使用产品＞

DNA损伤：DNA Damage Detection Kit – γH2AX (产品货号：G265)

SA-β-gal检测：Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal (产品货号：SG03)

NAD+量：NAD/NADH Assay Kit-WST (产品货号：N509)

线粒体膜电位：JC-1 MitoMP Detection Kit (产品货号：MT09)

糖酵解/氧化磷酸化：Glycolysis/OXPHOS Assay Kit (产品货号：G270)

(1) 按照上图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。

※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。

(2) 在每孔中加入50 μl Working Solution。

※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。

(3) 在37℃培养60 min。

※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。

(4) 用酶标仪在450 nm处检测吸光度。

(5) 用标准曲线测定样品中总NAD⁺/NADH和NADH的量。

※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。

※NAD⁺的量可用总NAD⁺/NADH的量-NADH的量计算得到

NAD⁺= 总NAD⁺/NADH-NADH

Q6：有使用组织的实验例子吗？

A6：我们已经用小鼠肝组织测量了NAD/NADH和ATP,有关实验操作的更多信息，请参见下文。

碱性提取法提取肝脏代谢指标

1.每100毫克小鼠肝脏500毫升500摩尔/升KOH的冷水。

请务必将纸巾彻底沥干。残余血液会影响测量。

2.它被向下型均化器粉碎。

*请去冰浴。

3.用500ml冷的0.5mol/l KOH水溶液共同洗涤用于破碎的容器，以匹配管中的样品。（共1毫升）

4.向样品管中加入1毫升冷的超纯水。（共2毫升）如果溶液的粘度高，操作后可能难以分离离心机。

在这种情况下，将25g（针的针数）的细针应用于注射器，并混合（20-30次），直到样品溶液顺利放入注射器。

5.在5000 x g，4°C下离心5分钟，上清液回收到两个900 mm L的样品管中。1个NAD/NADH测量和另一个用于ATP测量。NAD/NA

NAD/NADH测量样品的制备

将0.5mol/L KOH水溶液和1mol/L KH₂PO₄混合制备稀释溶液。KH₂PO₄水溶液，比例为9:5。

6.将样品转移到MWCO 10K膜沉积管中，并在15000xg下离心20分钟。

*如果溶液超过200克或更多，请延长离心时间。

7.将所得滤液加入1.5 ml微管μ中，转移总NAD+/NADH含量和NADH量样品。

8.NADH量测量样品在60°C下孵育60分钟，将样品冷却至室温。

9.中和完成后，加入1mol/L的KH₂PO₄。22μL放入装有总NAD+/NADH量和制备后NADH量测量样品的管中，

中和溶液，加入78ml稀溶液（KOH和KH₂PO₄），混合混合物，将样品用作测量样品（总计200ul）。

＜测定例＞

NASH诱导小鼠肝脏组织中NAD量的变化

Q7:测量样品可以保存吗？

A7.可以保存。使用说明书(1.测定用样品的调制的操作6）的溶液，在冷冻（-20℃）下可以保存3周。