α-淀粉酶活性的测定

α-淀粉酶活性的测定

所需材料

1.KPO4-NaCl缓冲液;25℃时含0.01 M氯化钠的0.1 M pH 6.9。将8.71克K2HPO4溶解在500毫升H2O中。用0.1 M磷酸二氢钾(6.8克/500毫升H2O)滴定至pH 6.9。添加氯化钠至0.01 M .小心!在下面的步骤2和3中使用通风罩和搅拌器/加热板。 2.底物溶液;1%可溶性淀粉。通过加热搅拌将1克溶解在80毫升H2O中至约。90°C,冷却并将体积调节至100 ml。 3.显色试剂;44.0毫米3,5-二硝基水杨酸。通过加热并搅拌ca,将1克3,5 DNSA溶解在80毫升0.5 M NaOH中。加入30克酒石酸氢钠,搅拌直至溶解。冷却至室温,用H2O定容至100 ml。储存在琥珀瓶中。室温下稳定30天。 4.麦芽糖标准品;0.01 M .将36 mg麦芽糖一水合物溶解在10 ml KPO4-NaCl缓冲液中。 5.酶溶液。用KPO4-NaCl缓冲液将淀粉酶稀释至0.05毫克/毫升。 6.在适合于100°c加热的试管中制备以下稀释液。 

磷酸亚铁锂氯化钠 α-淀粉酶活性的测定淀粉酶 毫升 微米 毫升H20
1次测试 0.50 0.01毫升 —– —– 0.40
2标准 0.5 ———- 0.05 0.5 0.45

将所有试管置于25°c下。在0点时,向试管1和6中添加0.5 ml底物溶液,并孵育2分钟。通过添加1.0毫升显色试剂来停止反应。在温度块中以100°加热所有试管10分钟。冷却至室温,向每个试管中加入2.5毫升H2O。让试管在室温下静置10分钟。 7.在540 nm处读取Abs与空白的对比。绘制Abs与麦芽糖μ摩尔的关系图。确定540/μM麦芽糖的斜率。 8.计算比活度,即每毫克淀粉酶在pH 6.9时每分钟释放的麦芽糖微米25°C

ROSGreenTM H2O2 Probe 过氧化氢荧光探针

ROSGreenTM H2O2 Probe 过氧化氢荧光探针

货号: JP5202-1MG 品牌: Jinpan 标签: 细胞生物学研究

描述

ROSGreenTM H2O2 Probe 过氧化氢荧光探针

搜索关键词:

Hydrogen Peroxide 过氧化氢;H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH);BES-H2O2-Ac;APF 氨基苯基荧光素; Mitosox Red;

同义名:

ROSGreenTM Hydrogen peroxide Probe;ROSGreenTM Hydrogen peroxide sensor;ROSGreenTM H2O2sensor;

产品信息

产品名称 产品编号            规格    价格(元)  
ROSGreenTMH2O2Probe 过氧化氢荧光探针     JP5202-1MG 1mg 1580

产品描述

过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)是一种反映氧代谢副产物,用于许多氧化应激相关态的关键调节剂,参与人体大量的生理和病理活动,比如哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、神经性衰退疾病和唐氏综合征等,但目前对H2O2生成、积累、运输和功能的分子机制仍了解很少,最大的限制在于缺乏灵敏且特异性H2O2探针,用于活细胞研究。目前能得到的H2O2反应性探针的缺陷包括1)来自其他ROS比如过氧亚硝基阴离子(ONOO-)、过氧化基(ROO•)、超氧化物(•O2–)的背景荧光干扰;2)对外源活化酶的需求;3)水缺乏水溶性或不兼容于水溶体系;4)以及紫外区域的激发光谱特征等。

本ROSGreenTMH2O2Probe正是克服以上缺陷开发的一款过氧化氢(H2O2)选择性探针。探针本身无荧光,可见光区域内无吸收峰。一旦接触H2O2,瞬间激发荧光增加并伴随可见波长吸收带的生成(Ex/Em= 490/514nm)。因其二元的吸收/发射荧光反应,此探针具有较大的动力学范围。与相似的ROS比如O2–,NO,或OCl-相比,ROSGreenTMH2O2Probe对H2O2呈现出>100倍(100-fold)的选择性。

保存与运输方法

保存:-20ºC避光干燥保存,至少1年有效。

运输:冰袋运输。

注意事项

1)本品的DJPO储存液需分装成单次用量后,-20ºC避光保存,避免反复冻融。所有工作液现配现用。

2)整个操作过程中注意避光。

3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1、储存液制备

将低温保存的产品从冰箱取出,置于室温回温至少20min。低速离心3-5min。之后往瓶内加入适量无水DJPO充分溶解配成2~5mM储存液(比如,1mg ROSGreenTMH2O2Probe(Mw: ~ 600)加入333μl DJPO,充分溶解混匀后即得到5mM储存液)。按照单次用量分装冻存,避免反复冻融,至少3个月稳定。

2、工作液准备

正式实验前,或取粉末按照【储存液制备】用DJPO溶解,或于室温融化一管DJPO储存液。

2.1 对于溶液H2O2测定,按照2~20μM工作液浓度制备2×工作液,用20mM Hepes缓冲液或其他缓冲液(pH 7.0)稀释储存液。工作液现配现用。建议使用5μM终浓度的ROSGreenTMH2O2Probe,测定溶液体系中H2O2浓度。

2.2 对于细胞H2O2测定,按照2~20μM工作液浓度制备1×工作液,用含20mM Hepes缓冲液的HBSS,pH 7.0 或PBS稀释储存液。工作液现配现用。

3、 上清液H2O2测定

【以下为溶液H2O2测定的推荐步骤,仅作参考,请根据具体需求做优化调整。】

3.1 于96孔板,加50μl 2×ROSGreenTMH2O2Probe工作液到每个孔(H2O2标准、空白对照、待测样本)内使总的测定体积为100μl/孔。【注意:对于384孔板,加25μl样品和25μl 2×ROSGreenTMH2O2Probe工作液,使得测定体积为50μl/孔。】

3.2 室温避光孵育反应体系15~60min。

3.3 荧光酶标板内监测用荧光增强,Ex/Em=490/525nm。

3.4 空白孔(只含有反应缓冲液)的荧光用作对照,其他孔的荧光值需减掉空白对照孔荧光。

4、活细胞H2O2测定

【ROSGreenTMH2O2Probe能主动扩散进入活细胞,且能反映胞内H2O2微摩尔浓度变化。以下是推荐的活细胞H2O2显微成像检测步骤,仅作参考,可根据具体需求优化调整。】

4.1 按照步骤2.2配制1×ROSGreenTMH2O2Probe工作液。工作液现配现用。

4.2 按照实验要求处理细胞。

4.3 用1×ROSGreenTMH2O2Probe工作液避光孵育细胞5~60min或适合自身需求的时间。用PBS清洗细胞2次。

4.3 用荧光酶标板(底部读数模式)监测荧光增强,Ex/Em=490/525nm。或者用荧光显微镜的FITC通道成像检测荧光增强。

染色示例

ROSGreenTM H2O2 Probe 过氧化氢荧光探针

图1. Costar 黑色96孔培养板内CHO-K1活细胞用ROSGreenTMH2O2Probe的染色图。图A:对照细胞;图B:用H2O2(100μM)处理5min后的细胞;

相关产品

货号 名称 规格
JP4801-1KIT         Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒     100~500T   
JP4802-50MG H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧(ROS)荧光探针 50mg
JP4802-250MG H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧(ROS)荧光探针 250mg
JP4804-1MG Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素 1mg
JP4805-1MG Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素 1mg
MM0707-500ML 30% H2O2Solution 30%过氧化氢溶液(30%双氧水) 500ml

 

 

 

规格信息

品牌:

Jinpan

CAS:

N/A

规格:

1mg

货期:

咨询客服