哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

哺乳动物细胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

该方案旨在对 GFP 标记的融合蛋白进行免疫沉淀,以通过蛋白质免疫印迹或活性测定进行分析。
溶液和试剂
1X 细胞裂解缓冲液:50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建议在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗涤缓冲液:TBS(50 mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH 7.5)
5X SDS 上样缓冲液
1. 准备细胞裂解物
1. 要在非变性条件下收获细胞,去除培养基并用冰冷的 PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板(10 cm,106-107 个细胞)中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷细胞裂解缓冲液(添加蛋白酶抑制剂混合物和 PMSF),并将板在冰上孵育 30-40 分钟,4 °旋转摄氏度。
2. 从平板上刮下裂解的细胞并转移到微量离心管中。继续冰上。
3. 在冰上对样品进行超声处理 3 次,每次 5 秒(可选步骤)。
4. 4°C、14,000 xg 微量离心 10 分钟,将上清液转移到新管中。如有必要,可将裂解物储存在 –80°C 下。
注意:如果目的蛋白是核蛋白,请使用RIPA裂解液裂解细胞,并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 颠倒产品管或轻轻上下吹打以重悬珠子。不要涡旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠浆到 EP 管(1.5 mL)中,然后加入 1 mL 冰冷的洗涤缓冲液。用手轻轻摇晃 1-2 分钟。不要涡旋珠子。
3、磁选60秒。
4. 弃去上清,重复洗涤 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 细胞裂解液,加入 25 μL 抗体偶联磁珠悬液,4°C 孵育 1-3 小时或 4°C 过夜。
4. 清洗蛋白质-纳米抗体-珠复合体
注意:如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白质,请减少洗涤次数,并降低洗涤缓冲液的离子强度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并悬浮珠子复合物,磁选,然后弃去上清液。重复上述步骤至少四次。
5. 下游分析的洗脱
GFP 融合蛋白的洗脱-根据蛋白质特性或进一步用途推荐两种洗脱方法:
选项 A:天然洗脱
在酸性条件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液(1 M Tris,pH 10.4)中和洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。中和缓冲液需要预先放入收集管中。
注意:需提前做初步实验,确定中和甘氨酸(PH 2.5)需要多少中和缓冲液
选项 B:SDS-PAGE 的变性洗脱
在凝胶电泳和免疫印迹的变性条件下用样品上样缓冲液洗脱。
A:用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脱 – 该过程应在室温下进行。
注意:不要将珠子留在该缓冲液中超过 20 分钟。
1. 向每个样品和对照珠复合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下轻轻摇动或在旋转器上孵育样品和对照 5-10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到含有 25-35 μL 中和缓冲液的新管中。小心不要转移任何珠子。
4. 重复步骤 1-3 以提高洗脱效率,将洗脱液集中在同一管中或通过不同管收集洗脱液。
6. 如需立即使用,请将洗脱液储存在 2-8 °C。储存在 –20 °C 以进行长期储存。
B:用 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱
1. 用 30 µL 1X SDS 样品上样缓冲液重悬每个样品(6 µL 5X SDS 样品上样缓冲液可以添加到 24 µL 细胞裂解缓冲液中)。涡流。
2. 在 95 – 100°C 下将样品管和对照管煮沸 10 分钟。
3. 将试管放入磁力分离器中以收集珠子。将上清液转移到新管中。样品和对照已准备好加载到 SDS-PAGE 上,并使用抗 GFP 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。

Luciferase/GFP Dual-Reporter HEK293 Cell LineLGL01


Luciferase/GFP Dual-Reporter HEK293 Cell Line

简要描述:Luciferase/GFP Dual-Reporter HEK293 Cell Line,产品型号:LGL01。
收到后立即储存在液氮气相中。该产品按指示储存可稳定 6 个月。

详细介绍

产品咨询

品牌 其他品牌 供货周期 一个月
应用领域 医疗卫生,环保,化工,生物产业,综合

Luciferase/GFP Dual-Reporter HEK293 Cell Line,产品型号:LGL01。

Luciferase/GFP Dual-Reporter HEK293 Cell Line,描述:

萤光素酶在 Mg2+ 和 ATP 存在的情况下催化底物萤光素,产生快速衰减的闪光。这种光可以用光度计检测。来自萤火虫的荧光素酶已成为体外和体内研究中使用更广泛的报告蛋白之一,例如基因转录活性测定、报告基因表达的无创成像、脑卒中成像和跟踪基因工程 T 细胞。荧光素酶/GFP 双报告基因 HEK293 (HEK293-Luc-GFP) 细胞系通过转导 ALSTEM 的 pLenti-CAG-荧光素酶-PGK-GFP-T2A-PURO 慢病毒报告基因 (cat# LV311G) 慢病毒,从 HEK293 细胞衍生而来,其中包含萤火虫CAG 启动子驱动的荧光素酶编码基因,PGK 启动子驱动的 GFP 和嘌呤霉素抗性基因。该细胞系以高水平稳定表达荧光素酶。它还表达绿色荧光蛋白 (GFP) 并且对嘌呤霉素具有抗性。该细胞系将是一种非常有用的细胞系,可用于体外和体内实验中的非侵入性可视化。

细胞系: HEK293

记者: 萤光素酶、GFP

选择标记: 嘌呤霉素

启动子/转基因:  CAG-Luc-PGK-GFP-T2A-puro

细胞类型: 单克隆

输条件

干冰 – 隔夜运输

储存和稳定性

收到后立即储存在液氮气相中。该产品按指示储存可稳定 6 个月。

质量控制

每个小瓶包含约 1 x 10 6 个细胞,冷冻前存活率 >95%。每一批细胞都经过冷冻保存恢复后的荧光素酶活性、生长和活力测试,并且不含支原体和感受态慢病毒。

限制使用

仅供研究使用。不得用于诊断或治疗程序。



上海金畔生物科技有限公司

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GFP抗体-抗GFP标签抗体

常用的标签包括GFP、HA、Flag、His、GST等。其中绿色萤光蛋白(Green Fluorescent Protein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。

GFP或其突变体EGFP等被广泛用于基因表达效率的检测,以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分布。一般来说,GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当的突变体,也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。

GFP标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等,相应的GFP标签抗体也被广泛应用。上海金畔生物科技有限公司致力于为客户提供最具性价比的免疫学试剂和解决方案,如各种标签抗体、内参抗体、常规一抗以及全系列二抗,抗体检测底物以及相关试剂盒等。针对GFP标签抗体,则有多种不同样式产品供您选择。

上海金畔生物科技有限公司提供的GFP标签抗体均为原装进口包装,且备有现货,有GFP单抗和多抗不同样式供您选择。上海金畔生物科技有限公司提供的所有优质标签抗体产品,条带清晰,高效敏感,能为您提供最值得信赖的标签抗体产品保障和售后服务。

货号 产品名称 宿主 应用 价格/规格
50430-2-AP Anti-GFP Rb WB/IP/IHC/IF/ELISA ¥958/250μl
  产品说明:美国ProteinTech原装进口抗体,兔源多抗,可用于WB、IHC、IP、IF、ELISA等检测,650ug/ml,免疫原为重组蛋白,WB推荐稀释度为1:1000-1:3000。
CB100141M Anti-GFP Ms WB/ELISA ¥1600/100μg
  产品说明:美国Cali-Bio原装进口抗体,鼠源单抗,可用于WB、ELISA等检测,免疫原为KLH耦联的水母GFP蛋白的N末端多肽,能检测GFP以及EGFP,YFP,EYFP,CFP等变体. 100μg/100μl,100μg包装,WB稀释比率为1:1000。
更多GFP抗体请来电查询,价格可能有调整,及时报价请使用货号在本站右侧产品查询栏内查询。

作为多家国际知名抗体公司的中国一级及一级代理商,上海金畔生物科技有限公司致力于为客户提供最具性价比的常规免疫学试剂,如各种标签抗体、内参抗体、常规一抗以及全系列二抗,抗体检测底物以及相关试剂盒等。针对标签蛋白的检测及标签抗体,除了上述GFP标签抗体外,还有其它常规标签抗体,如GST抗体、Flag抗体、HA抗体、His抗体、Myc抗体等标签检测抗体,均备有现货

另外,上海金畔生物科技有限公司还提供全系列原装进口二抗现货备货,如果您对上述产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。

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你知道荧光蛋白由何而来吗?

近几年,荧光蛋白在生物研究领域中的应用呈爆发式增长,1962年,维多利亚水母绿色荧光蛋白(GFP)首次被发现,1992年被成功克隆,并在1994年首次作为荧光标记用于体内标记。

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后来出现了各种GFP变体。此后科学家们也陆续鉴定了来自其他物种的荧光蛋白,颜色呈现出绿色、黄色、蓝色和红色等,常见荧光蛋白的光谱参数如下表。

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红色荧光蛋白mCherry及其抗体

mCherry也叫樱桃荧光蛋白、DsRed或红色荧光蛋白等,是一种被广泛应用的红色荧光标签蛋白,常用于分子的标记和细胞组分的定位等。不同于从水母中分离的GFP蛋白和其它GFP变体,mCherry是从珊瑚(Discosoma)中分离出来的单体红色荧光蛋白,可以和GFP系列荧光蛋白共用,实现多色标记。体内、体外实验表明,将mCherry融合表达在目的蛋白的N端或C端时,mCherry荧光蛋白活性和目的蛋白功能相互没有显著影响,因此mCherry比其它荧光蛋白标签更受欢迎。此外,mCherry在标记病毒方面还有得天独厚的优势,研究者们常用mCherry标记HIV病毒来研究HIV和宿主细胞间的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程。

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上海金畔生物科技有限公司代理的SICGEN品牌提供的Anti-mCherry和Anti-tdTomato均为从圆盘珊瑚中提取的红色荧光蛋白的多克隆抗体。tdTomato是由两个mCherry单体串联表达的二聚体,因其荧光比mCherry更强且对细胞/小鼠等没有明显毒性,因此更常用于活体实验。Anti-mCherry和Anti-tdTomato两种抗体的抗原均是大肠杆菌表达的重组多肽纯化而来,用Western blot检测转染了两种蛋白的HEK293细胞,分别可检测到29kda和55kda的条带。Anti-tdTomato抗体对tdTomato和mCherry均有特异性,但与绿色荧光蛋白(GFP)不发生交叉反应。

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mCherry抗体产品信息

SICGEN品牌的anti-mCherry和Anti-tdTomato适用于多种免疫学实验,且拥有优异的特异性、稳定性及售后服务,一直是该品牌的明星产品,受到了广大客户的好评。为了方便大家挑选,小编整理了SICGEN品牌mCherry系列抗体的产品信息表:

货号

规格

产品名称

来源

应用

AB0081

600μg/1.5mg

Anti-mCherry

Goat

WB、IF、ICH(P)、ICH(F)、IEM

AB8181

600μg

Anti-tdTomato

Goat

WB、IF、ICH(P)、ICH(F)

AB0040

600μg/1.5mg

anti-mCherry

Goat

WB, IHC (F), IHC (P), IF, IEM

AB9770

200μg

Anti-mCherry

Chicken

WB、IF、ELISA

SICGEN