ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA：蛋白质检测工具的比较
介绍
ELISA（酶联免疫吸附测定）是蛋白质检测的“金标准”方法。1在本博客中，回顾了三种流行的 ELISA 平台：标准 ELISA、免疫 PCR和单分子阵列 (SIMOA)。我们将对这些 ELISA 的设计原理、样本量、仪器和灵敏度进行比较。
ELISA 的工作原理
ELISA的基本设计原理取决于抗体-抗原相互作用的稳定性和特异性。简而言之，固定在珠子或微孔板等固体基质上的捕获抗体可与多种样品类型中的目标蛋白结合。此类样品可包括血浆、血清、细胞和组织裂解物、条件培养基或尿液。
1971 年引入 ELISA 时，酶标记抗原被纤维素颗粒上的抗体捕获。2然后通过反复离心和洗涤分离抗体-抗原缀合物。此后，不同的 ELISA 格式被开发出来，包括夹心 ELISA，其中目标蛋白“夹在”捕获抗体和标记检测抗体之间（图 1）。这种 ELISA 格式具有高度特异性，因为需要两种抗体与蛋白质结合才能进行检测。此外，可以用标准曲线确定蛋白质浓度（即定量数据）。
这里讨论的 ELISA 平台——标准 ELISA、免疫 PCR和单分子阵列 (SIMOA) ——是生成定量数据的夹心 ELISA。然而，它们在底物、检测方法、仪器、样品体积和灵敏度方面有所不同。
标准酶联免疫吸附试验
标准 ELISA (sELISA) 将捕获抗体固定到透明塑料 96 孔微孔板上（图 2、表 1）。该检测抗体与辣根过氧化物酶 (HRP) 结合，该酶可将其底物 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB) 还原为蓝色和氧化形式。颜色的变化与 HRP 的量成正比，并且推论与样品中目标蛋白的量成正比。添加硫酸可终止 HRP-TMB 反应，导致颜色从蓝色变为黄色。使用酶标仪在 450 nm 处测量吸光度。
| 标准 | 免疫PCR | SIMOA™ | |
|---|---|---|---|
| 基质 | 96孔微孔板 | 96孔PCR板 | 珠子 |
| 检测方法 | 比色法 | 聚合酶链式反应 | 荧光 |
| 乐器 | 读板器 | 实时荧光定量PCR仪 | 专用仪器 |
| 样品量* | 100微升 | 10-25 µL | 125微升 |
| 灵敏度 | 高的 | 更高 | 最高 |
表 1. 标准 ELISA、免疫 PCR 和单分子阵列 (SIMOA) 的比较。 * = 样品稀释后每次重复的最终体积。
sELISA 的灵敏度一般范围为 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而，一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亚 pg/ml 或高达 10 ng/ml。与所有 ELISA 一样，灵敏度取决于所用抗体的灵敏度。
对于标准 96 孔板，最终样品体积为每孔 100 µL。使用“半面积”板可以减少体积 (50 µL) ，其中孔的直径为一半宽，但测定灵敏度也可能会降低。用于任何ELISA 的原始样品体积将取决于最佳样品稀释度，该稀释度会因蛋白质、样品类型和实验而异。
将样品添加到板中后，大约 5 小时内即可获得结果。然而，当样品和抗体同时添加到板中时，可以实现更快的周转时间。这减少了孵育步骤和洗涤步骤的数量。例如，SpeedELISA的处理时间为 3 小时，在添加样品之前同时孵育板上的捕获和检测抗体。其他方法包括一步添加样品和两种抗体，或者将样品和检测抗体一起添加。然而，减少处理时间会降低灵敏度（图 3）。
sELISA 的主要优点是提供低成本试剂盒，可以针对来自多个物种的数千种不同蛋白质。此外，sELISA 几乎不需要培训，可生成易于解释的数据，并使用与其他检测兼容的经济实惠的酶标仪。这些优点导致 sELISA 在研究中得到广泛使用。
免疫PCR (IQELISA TM )
免疫 PCR也称为免疫定量 ELISA (IQELISA)，将捕获抗体粘附到塑料 96 孔 PCR 板上，同时检测抗体与 DNA 条形码缀合（图 4、表 1）。使用 PCR，双链 (ds) DNA 条形码在条形码特异性引物和与 dsDNA 结合的荧光染料存在的情况下分别被扩增和染色。荧光与 dsDNA 的量成正比，因此也与样品中目标蛋白的量成正比。使用实时 PCR 仪器测量荧光。
IQELISA 的一个优点是其体积要求小，每次重复的最终体积仅为 10 µL。因此，当样品量有限或难以获得样品时，IQELISA 是一个特别有吸引力的选择。然而，IQELISA 比 sELISA 在技术上更具挑战性，因为它需要更精确的移液。此外，样品应至少重复三次，因为小体积会增加异常值的机会。
DNA 通过 PCR 扩增循环呈指数增长。因此，与使用相同抗原和抗体对的 sELISA 相比，IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。灵敏度的增加取决于抗体，范围从无变化到 105 倍（图 5）。
从样品孵育到数据收集，IQELISA 大约需要 5.5 小时。该周转时间与 sELISA 类似。
单分子阵列 (SIMOA TM )
SIMOA是一种超灵敏 ELISA，使用抗体包被的珠子和荧光偶联的检测抗体（图 6、表 1）。将珠子、样品和检测抗体混合在一起后，将溶液施加到具有超过 235,000 个微孔的卡盒中。每个微孔只能容纳一颗珠子。然后将油添加到卡盒中，将样品推过微孔阵列的表面并形成孔的液密密封。
使用配备荧光显微镜的全自动或半自动系统测量荧光；该仪器由 SIMOA（ Quanterix ；Billerica，MA；美国）开发商制造。由于每个孔只能包含一个珠子，因此具有荧光的微孔的数量与样品中目标蛋白的量成正比。这使得单分子检测成为可能。
SIMOA 的一个关键优势是它可以检测飞摩尔范围内的蛋白质。也就是说，灵敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范围内。与 sELISA 和 IQELISA 相比，SIMOA 的平均灵敏度分别提高了 465 倍和 63 倍。
将试剂装入 Quanterix 仪器后，大约需要 3 小时才能获取数据。因此，SIMOA 的程序时间比 sELISA 和 IQELISA 都短。
虽然 SIMOA 实现了此处评测的三个平台中的一些最高灵敏度，但该技术也有一些缺点。首先，目前使用该技术分析的蛋白质数量很少（~165）。其次，SIMOA 试剂盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 试剂盒。第三，检测仪器价格昂贵，且只能用于SIMOA，是专用仪器，需要专门培训才能运行。
多重ELISA
值得一提的是，IQELISA 和 SIMOA 分别可以同时分析多达 3 个和 6 个目标。除了需要更少的样品之外，在分析相同数量的蛋白质时，多重检测通常比单重检测更具成本效益。重要的是，多重检测会降低 IQELISA 的灵敏度，而使用SR-X TM生物标志物检测系统的SIMOA 则不会影响灵敏度。
还提供其他定量多重 ELISA 选项，包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗体阵列。Quantibody可以使用 100 µL 稀释样品在 6 小时内分析多达 40 种蛋白质，一式四份。使用兼容的激光扫描仪采集数据。RayPlex可以使用流式细胞术在 4 小时内每次重复使用 25 µL 稀释样品测量多达 25 种蛋白质。两种抗体阵列的灵敏度与 sELISA 相似。
在我们的博客“使用抗体阵列进行多重蛋白质检测“或我们的视频“为您的研究识别正确的抗体阵列“中了解如何确定用于多重蛋白质检测的正确抗体阵列。
概括
标准 ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比较时具有优点和缺点：
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sELISA是一种简单的比色测定法，数据易于解释，因此几乎不需要培训。使用能够测量 450 nm 吸光度的酶标仪在 5 小时内获得数据。使用比 IQELISA 和 SIMOA 试剂盒便宜的试剂盒可以靶向数千种不同的蛋白质。然而，与 IQELISA 和 SIMOA 相比，sELISA 的灵敏度低。
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免疫PCR使用实时PCR仪器，在6小时内收集数据。在此介绍的三个 ELISA 平台中，它的体积要求低，但比 sELISA 需要更多的移液和数据分析技术专业知识。平均而言，其灵敏度比 sELISA 高 23 倍。可以同时检测 3 种蛋白质，但检测灵敏度会降低。
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SIMOA的灵敏度最高，其灵敏度平均分别比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要专门培训的昂贵专用仪器可在 3 小时内获得数据。它还需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的样本量。一次可以分析多达 6 种蛋白质，而不会影响灵敏度。
图 8 表明，对于许多蛋白质，LLOQ 的总体改进遵循以下趋势：SIMOA > IQELISA > sELISA。不过，也有例外。例如，IQELISA 对人 IL-1β 的灵敏度最高，为 0.0064 pg/ml，而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分别为 0.3 和 0.04 pg/ml。
结论
最常见的蛋白质检测工具之一是 ELISA。在这里，我们比较了三种流行的夹心 ELISA 平台：标准 ELISA、免疫 PCR和单分子阵列 (SIMOA)。在为研究选择合适的 ELISA 时，其底物、检测方法、仪器、样品量、灵敏度和成本是重要的考虑因素。标准 ELISA 是流行的方法，因为 可以使用低成本 试剂盒来靶向来自多个物种的数千种不同蛋白质。此外，它几乎不需要培训即可运行，其数据易于解释，并且使用非专用 酶标仪 与其他测定兼容。一个关键要点是 ELISA 灵敏度和成本之间需要权衡：灵敏度越高，成本越高。成本考虑了套件、培训、劳动力和所需仪器的价格。因此，sELISA 是实惠的选择，而 SIMOA 是最敏感的。
对于不具备必要的专业知识或设备来使用此处讨论的 ELISA 平台分析样品的实验室，RayBiotech Life, Inc. 提供完整的测试服务。该服务提供完整的报告，包括原始数据、标准曲线和定量数据。蛋白质浓度。
