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细胞内吞作用(Endocytosis)是一种通过细胞膜形成内体(Endosome)的细胞摄入机制。内吞作用不仅可以将各种营养物质摄入到细胞内，还可以将细胞内外的有害物质转运至溶酶体中分解，帮助维持细胞稳态。近年来的研究发现，内吞作用的紊乱与很多神经变异性疾病和免疫疾病密切相关，因此受到了广泛关注。而通过荧光探针标记细胞内吞作用摄入的葡聚糖，是最广泛使用的一种研究方法。但是由于葡聚糖的大小不固定，细胞摄入时的通路以及细胞内动力学都会随之发生变化。所以急需一种更准确的研究细胞内吞作用通路的方法。

ECGreen是一种细胞膜非透过性的小分子荧光染料，它可停留在细胞膜上。随着内吞作用进入细胞后，内体中的酸性环境会使它的荧光增强。与传统的标记葡聚糖的方法不同，ECGreen通过对内体的膜直接染色，可以更准确的进行活细胞内的内吞作用通路分析。

目前最常用的细胞内吞作用可视化的方法是荧光标记葡聚糖或细胞膜，由于准确性差和停留时间短等缺点，在进行细胞内吞作用的动态观察时存在各种各样的问题。而ECGreen可以解决上述问题。

ECGreen-Endocytosis Detection可以染色内体的膜，随着pH的变化荧光强度发生变化。因此与其他公司的通过标记蛋白质的方法相比，可以更直接的观察初级阶段的内体。

ECGreen-Endocytosis Detection与传统的荧光标记葡聚糖的方法相比，对pH变化的应答性更优秀。因此可以高灵敏的检测初级内体。

实验例：通过悬浮细胞观察内吞作用对温度依赖性的变化

本实验使用ECGreen内吞检测试剂（产品货号：E296）和PlasMem Bright Red（产品货号：P505）染色，对Jurkat细胞内吞时对温度的依赖性变化

<检测条件>

内体检测(ECGreen, 绿色): Ex. 405 nm / Em. 500 – 560 nm

细胞膜检测 (PlasMem Bright Red,红色): Ex. 561 nm / Em. 560 – 700 nm

<实验步骤>

（1）在样品管中加入Jurkat细胞悬液（10%FBS，RPMI）并在4℃或37℃孵育30min。

（2） 使用步骤（1）配置的细胞悬浮液将ECGreen溶液稀释1000倍。

（3） 4℃或37℃孵育30min。

（4） 用HBSS清洗细胞两次。

（5） 加入含有PlasMem Bright Red（100倍稀释）的培养基，悬浮细胞。

（6） 将悬浮液转移到成像板上，并使用共聚焦显微镜观察细胞。

 实验例：使用药物后初期内体的观察

Wortmannin是一种阻碍内体向循环内体(Recycling endosome)和溶酶体(Lysosome)转变的药物，可造成内体肥大。Wortmannin作用后通过ECGreen(绿)和下列试剂进行共染色。

初级内体(Early Endosome)： Rab5-RFP(红)

循环内体(Recycling Endosome)：荧光标记Transferrin(红)

次级内体(Late Endosome): Rab7-RFP(红)

溶酶体(Lysosome): Lamp1-RFP(红)

结果显示，ECGreen(绿)由于Wortmannin的作用仅与肥大化的初级内体和循环内体共同存在（图①和②），而不与次级内体和溶酶体共同存在（图③和④）。 因此，ECGreen可以准确可视化细胞内体的转运和形态变化。

 实验例：内体局部实时观察

用共聚焦激光显微镜观察ECGreen时，即使染色后不清洗也可以观察到内吞作用产生的荧光亮点。 作为使用ECGreen的应用实验的一个例子，HeLa细胞用ECGreen（绿色）和溶酶体染色剂（红色）染色，并确认了成像图像的时间变化。

结果证实了随着时间的流逝，内体与溶酶体共定位。

<观察条件>

内体 (ECGreen, 绿)  Ex. 405 nm / Em. 500-560 nm

溶酶体 (Lysosome染色试剂, 红)  Ex. 561 nm / Em. 600-700 nm

清洗后观察和不清洗观察，所获得的成像图像具有以下特征。

〇染色后不洗：

由于染料可以保留在细胞膜中，因此可以随时间观察内吞状态。

那时，在细胞膜上也观察到荧光亮点，因为过量的染料残留在膜上。

〇染色后清洗：

通过去除残留在细胞膜上的多余染料，可以更清楚地观察到来自内吞作用的荧光亮点

λex: 386 nm,  λem: 522 nm

<观察条件>

Ex. 350~410 nm / Em. 500-560 nm

1、Y. Miyakawa, M. Otsuka, K. Sekiba, K. Funato, K. Koike, “Humanized virus-suppressing factor inhibits hepatitis B virus infection by targeting viral cell entry”, Heliyon,  2021, doi:10.1016/j.heliyon.2021.e07586.

2、H. L. Marko, N. C. Hornig, R. C. Betz, P. Holterhus, J. Altmüller, H. Thiele, M. Fabiano, H. Schweikert, D. Braun, Ul Schiweizer, “Genomic variants reducing expression of two endocytic receptors in 46,XY differences of sex development”, Hum. Mutat. 2022, doi:10.1002/humu.24325.

3、K. Qiu, R. Seino, G. Han, M. Ishiyama, Y. Ueno, Z. Tian, Y. Sun, J. Diao, “De Novo Design of A Membrane-Anchored Probe for Multidimensional Quantification of Endocytic Dynamics”, Adv. Healthcare Mater., 2022, doi:10.1002/adhm.202102185.