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概述 – 定量“实时”PCR 或 qPCR

定量实时 PCR 改变了我们测量核酸浓度的能力，并且是验证微阵列分析和其他基因组技术生成的表达数据的重要一步。实时 qPCR 仪器的开发促进了这一点，该仪器可测量反应每个步骤或“实时”产生的 qPCR 产物的量。 SYBR green 因其相对简单和可靠而成为目前流行的实时 PCR 方法。在实时 PCR 技术发展之前，定量测量需要设置多个 PCR 反应，以便在扩增的线性阶段捕获 qPCR 产物。然后通过凝胶电泳或 HPLC 进行 PCR 产物的分离和定量。这些实验非常费力，并且实现正确定量所需的操作次数增加了引入错误的可能性。因此，能够在每个热循环测量 PCR 产物的实时 PCR 仪器的开发提高了定量 PCR 的简便性、准确性和重现性。由于实时 PCR 的发现，出现了多种应用。其中包括 1) 通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据的验证，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。实时 PCR 仪器的开发可以在每个热循环中测量 PCR 产物，从而提高了定量 PCR 的简便性、准确性和重现性。由于实时 PCR 的发现，出现了多种应用。其中包括 1) 通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据的验证，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。实时 PCR 仪器的开发可以在每个热循环中测量 PCR 产物，从而提高了定量 PCR 的简便性、准确性和重现性。由于实时 PCR 的发现，出现了多种应用。其中包括 1) 通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据的验证，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。其中包括 1) 通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据的验证，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。其中包括 1) 通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据的验证，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。

一般来说，实时 PCR 方案与标准 PCR 反应类似。同样的问题也适用于生产干净的模板、设计引物和优化反应条件。主要区别在于加入了 SYBR green 等嵌入剂或使用荧光引物来检测 PCR 产物。在典型的反应中，qPCR 产物的产生呈指数级增长。由于需要几个循环才能轻松检测到足够的产物，因此荧光与循环数的图呈现 S 形外观。在稍后的循环中，反应底物耗尽，qPCR 产物不再加倍，并且曲线开始变平。曲线上荧光量开始快速增加的点，通常比基线高几个标准差，称为阈值循环（Ct 值）。 Ct 与模板的关系图是线性的，因此比较多个反应之间的 Ct 值可以计算出目标核酸的浓度。这条线的斜率提供了 qPCR 效率的衡量标准。

PCR产物可通过生成标准曲线来定量或相对于对照基因进行定量。基于标准曲线的实时PCR定量可以利用质粒DNA或其他形式的DNA，其中每个标准的绝对浓度是已知的。然而，必须确保标准品的 PCR 效率与“未知”样品的 PCR 效率相同。在某些情况下，从纯化的靶标中进行 PCR 比用复杂的核酸混合物观察到的效率更高。相对定量方法稍微简单一些，因为它需要测量管家或对照基因以使目标基因的表达标准化。然而，选择适当的控制基因可能会引起问题，因为它们不一定在所有未知样本中均等表达。这可以通过对一组管家基因进行标准化测量来避免，以避免这种变异性问题。

进行实时 PCR 的一个关键方面是从高纯度的模板开始。在处理某些生物样品时，这可能具有挑战性。幸运的是，已经开发了许多商业产品来促进高纯度核酸的分离。去除污染性苯酚和不需要的 DNA 是需要考虑的步骤。对于基因表达研究，必须使用高纯度试剂并多次重复进行逆转录，因为此步骤可能会引入模板复制的变异性。逆转录可以在实时PCR之前进行，或者可以并入扩增程序中。

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