如何选择染料

为了使用荧光标记物获得最佳结果，必须考虑几个因素。

首先，这是激发光源：为了减少样品自发荧光可能产生的干扰，激发波长优选在550 nm甚至600 nm以上。除了减少背景之外，红色光谱范围在处理活细胞时也具有优势，因为可以减少损伤。

其次，荧光标记应在激发波长下具有强吸收以及高荧光量子产率。消光系数和荧光量子产率的乘积通常称为染料的“亮度”。

染料的荧光效率在光谱的蓝色和绿色区域最高。在某些情况下，量子产率几乎达到100%的理论极限。对于更长的波长，发射的量子产率急剧下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功开发出即使在 650 nm 下也具有高量子产率的荧光标记。例如，ATTO 647N在水溶液中发出的荧光强度是旧花青染料 Cy5 ™的两倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相对荧光强度。PBS 水溶液1 cm 池中相应吸收最大值处的吸光度为 0.04。22 °C 时两个吸收光谱（相同吸收）交叉处的荧光激发。

 
最后，标记物的发射光谱应与所用滤光片组的传输相匹配。反过来，必须选择滤光片组，使其阻挡样品散射的激发光并允许荧光尽可能有效地通过。

当使用波长为 635 nm 的二极管激光器作为激发源以及在 650 nm 至 750 nm 之间具有高透射率的滤光片组时，例如ATTO 647N将是一个非常好的选择。从ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm处具有高消光系数，接近吸收曲线最大值的波长，以及优异的荧光量子产率（η fl = 65%）。

下表概述了一些常用的激励源和推荐的ATTO标签。
 

荧光标记物的特性
然而，应该注意的是，除了已经讨论的光学考虑因素之外，选择标记时其他因素也很重要，例如染料的 pH 依赖性光学和化学特性、其溶解度、光和化学特性稳定性、发色团的大小或连接体的长度等，其涉及或满足各自应用的要求。这些特性与染料作为荧光标记物的适用性非常相关。

最重要的是，染料在照射过程中保持完整。许多常见的标记，例如荧光素衍生物 FITC，具有非常低的光稳定性。因此，当长时间观察过程时，使用高强度激光激发时成像的灵敏度和质量会受到限制。这对于显微镜和其他基于共焦原理的技术（例如单细胞的检测）来说是一个严重的缺点。与一些常用的旧染料相比，新型ATTO标签的设计即使在长时间暴露后也显着更加稳定。

ATTO 655与传统 Cy5的光稳定性比较TM在水里。使用 250 W 卤钨灯照射，聚焦到 1 cm 池中。消光与照射持续时间。

许多常见的荧光标记物即使在没有照射的情况下（即在黑暗中）也会分解，特别是当暴露于实验室大气中的低浓度臭氧时。在相同的臭氧暴露条件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的稳定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM长 100 倍。这在微阵列应用中非常重要，因为染料分子位于表面，因此直接暴露在大气中。

紧凑而强大的激光二极管现在覆盖了光谱的整个可见光和近红外部分。它们已作为非常有效的激发源进入许多应用/设备，并越来越多地取代传统光源。

如果没有最大吸收与现有激发源的波长完*对应的标记，则应选择波长稍长的染料。吸收会稍微降低，但激发波长和荧光光谱之间的较大差异（与激发波长无关）具有在检测过程中更好地分离散射激发光的优点。

荧光量子产率的测定

除了荧光的光谱位置外，荧光量子产率（η fl；英文fluorescence quantum y field，QY）是荧光团的一个重要光学参数。除了消光系数的大小，当染料用作荧光标记时，量子产率的水平特别决定了获得的信号强度：因此在英语用法中，消光系数和量子产率的乘积被称为作为荧光团的“亮度”。

量子产率本质上取决于染料的分子结构，但也受到许多外部因素的影响。这些包括环境的温度、粘度、极性和pH值。这种环境可以由溶剂分子和任何溶剂组成，也可以由例如偶联的生物分子或细胞膜组成，荧光染料位于其附近。通过改变荧光，可以得出有关环境某些特性的结论：可以说，荧光染料充当分子探针。

荧光量子产率定义为以荧光形式发射的光子数（= 光量子）与样品先前吸收的光子数之比：如果所有



吸收的光子都以荧光形式发射，则量子产率为 1 或 100 % 获得。然而，激发态的非辐射失活过程总是与发射竞争，因此部分吸收的能量以热量的形式释放到环境中。

正是这种现象被用于绝对判定通过“量热”方法（例如热开花方法）的量子产率。这需要相对复杂的测试设置以及对测量概念和评估的全面理论理解。

更简单地说，荧光团（样品）的未知量子产率可以通过将其与荧光光谱仪中标准或参考染料（参考）的已知量子产率进行比较来确定。这种所谓的相对确定可以通过不同的方式进行：

• 在单次测量中比较样品与参考染料

• 在几个单独的测量中将样品与几种参考染料进行比较

• 将样品与不同浓度的参考染料进行比较，并对获得的测量值进行后续评估。

结果的统计准确性随着进行的比较测量的次数而增加。

使用相对方法的理论先决条件是要比较的两种溶液，样品和参考，在激发波长下具有相同的吸收，因此吸收相同数量的光子。然后两种溶液在相同条件下记录的积分荧光光谱的商（IF = 荧光带的面积）给出两种染料的量子产率比，这样就可以很容易地计算出未知的量子产率：



记录样品和参考的整个荧光光谱（积分荧光强度）的重要性通过以下示例用这种比较方法进行了说明：染料



ATTO 488羧基和ATTO 430LS羧基在吸收光谱的交叉点被激发（相同的吸收) 和测量的荧光光谱。与标准品（罗丹明 6G）的比较测量导致ATTO 488羧基的荧光量子产率为 80%。使用此值，使用描述的相关方法获得ATTO 430LS的 65% 的值羧基。另一方面，如果您只查看相应荧光最大值处的强度，您只能从ATTO 488羧基的已知 80% 中获得 33% 的ATTO 430LS羧基。这种强烈的差异是由于荧光带的宽度不同，即两种染料的荧光光谱分布不同。 通过使用相同的测量参数，可以从设备端实现用于记录样品和参考荧光光谱的相同条件。这些包括光束路径的几何形状（例如 90° 或正面布置）、检测器放大（增益）、狭缝宽度（或带通）和相同的激发波长。


例如，可以选择样品和参比的长波吸收带的交点作为激发波长。然后，在染料条带的相应最大值处的吸收可能略有不同。
使用示例 阿托 488 羧基和 阿托 532 羧基在各自的吸收最大值处的吸光度值略有不同，这一点变得很清楚：在记录了两种测量溶液的吸收光谱后，可以通过叠加两种光谱来确定两种溶液具有相同吸光度（此处为0.0183）的交点（此处为513.1 nm）。（对于较小的值，吸光度和吸光度相同。



另一方面，如果决定在样品和参考的吸收最大值处激发，则两种溶液在各自波长下必须具有相同的吸收。在所示示例中，ATTO 488羧基可在 500 nm 激发，ATTO 532羧基可在 532 nm 激发；两种溶液的吸光度均为 0.0420。



在这种情况下，必须在荧光测量中对两个激发波长下的不同激发强度进行相应的校正。在现代荧光光谱仪中，这种与波长相关的强度差异由光电二极管确定为标准，同时还测量激发光源随时间的强度波动。此校正必须在测量期间通过设备软件激活，因为此后将无法再进行。

此外，所选测量范围应覆盖整个荧光光谱，即长波边缘的测量强度应几乎降至检测器噪声水平。

即使满足所有这些要求，荧光量子产率的精确测定在实践中也非常苛刻，需要做好充分的准备和仔细的测量。

 
关于量子产率测量和可能的误差来源的说明
 

• 参比染料必须合适，并且必须足够精确地知道其量子产率。例如，可以通过将其与另一个参考进行比较来确保这一点。

• 参比染料的选择方式应使其能够在与样品相同的范围内被吸收，即激发。理想情况下，两个吸收光谱重叠，并且可以在荧光测量期间在两个波段的交叉点激发。

• 必须保持所有玻璃器皿和比色皿绝对清洁。

• 使用的溶剂应具有“光谱学”规格，并应检查其固有荧光。

• 例如，如果由于溶解度的差异而将不同的溶剂用于样品和参比，则必须通过在计算中包括两个折射率n来考虑这一点：

• 对于荧光测量，应使用光程长度为 10 mm 的标准荧光比色皿。

• 为了减少重吸收效应的发生，10mm电池中的吸光度不应超过0.05。
  在较高浓度下，可能会发生所谓的内部滤光片效应，这极大地伪造了荧光测量：
  一方面，激发光不再深入溶液，这可能导致比色皿中心的样品激发减少。
  另一方面，从那里发出的荧光在离开比色皿之前通过溶液时被光束路径中的其他荧光团部分（重新）吸收。这导致荧光光谱在短波范围内被切断。

• 必须注意确保吸收测量的基线不会因未溶解颗粒或脏比色皿窗口的光散射而失真。

• 顺便说一下，这种散射现象也会干扰荧光测量，因为散射光可以到达溶液中颗粒或比色皿表面上的检测器。因此，在测量前应μ过滤所使用的溶剂和溶液，并用不起毛的布从外部擦拭比色皿窗口。注意：指纹！

• 荧光测量的测量参数（增益、狭缝宽度）必须适应发生的荧光强度，以便所使用的检测器（例如光电倍增管）不会因过多的光而损坏。测量必须在探测器的线性范围内进行，因为只有这样，测量的光强度才会与照射的光强度成正比。

• 人们应该意识到温度对测量结果的影响。

 
许多制造商现在都包含使用其荧光光谱仪测量荧光量子产率的精确说明和工作说明，也可以从相应网站下载。通常也可以在这里找到有关相应设备设置和测量参数的详细信息和注意事项。正在努力开发荧光标准的方法和程序。我们给出的荧光光谱是用HORIBA Jobin Yvon的

Fluorolog 3荧光光谱仪测得的。为此，ATTO-染料在 22°C 下检查水溶液（PBS，pH 7.4）中的相应羧基衍生物。测量是在标准的 90° 排列中进行的，具有水平的激发和发射极化。为了确定ATTO染料的荧光量子产率，将具有荧光量子产率的荧光团用作参考染料。取决于光谱范围，例如B、使用罗丹明6G、罗丹明630等。

荧光光谱的一般信息

在吸收光谱仪的情况下，几乎只使用双光束装置，其中样品溶液和参比物质（例如带有纯溶剂的比色皿）“同时”扫描。结果，获得的频谱成为所谓的 设备特性 这是由于单色器（光栅、狭缝）和镜子反射的不同透射率，除其他外，对于不同的偏振光和特定的检测器特性。

由于荧光光谱中原则上不存在这种参考光束路径，因此必须以不同的方式校正每个荧光光谱仪的器件特性，具体取决于光学元件和光束路径的路径，这些特性是不同的，以获得样品的“真实”荧光光谱。

在现代荧光光谱仪的情况下，控制和评估软件通常包含所谓的 校正功能，可用于在测量过程中直接或通过用户的后续指令校正被测设备光谱。此校正功能由制造商创建，例如，通过将相关设备测量的发射光谱与校准灯的实际发射光谱进行比较。

除此之外，在每次荧光测量中都应考虑另一种现象。这些是 荧光偏振： 只有当荧光团在激发态的生命周期内能在培养基中自由移动时，才能获得非偏振荧光。在这种情况下，水平和垂直偏振荧光的比例是相同的。

自由迁移率受溶剂的温度相关粘度和分子体积的影响。

在丙酮、甲醇、乙醇和水等低粘度溶剂中，这种极化效应通常只在室温测量中寿命在纳秒范围内的小型有机荧光团中起次要作用。

但是，如果样品和/或参比的荧光由于分子尺寸和/或荧光寿命的强烈不同而不再非偏振甚至不同的偏振，则可能导致测量的荧光光谱伪造，从而导致错误计算的量子产率。

为了确定荧光基团溶液的荧光偏振，有一种相对简单的方法，可以在J. R. Lakowicz中找到其理论推导和解释。

研究与大分子（聚合物、蛋白质、DNA等）偶联的荧光标记物的荧光偏振，其自由迁移率在其激发态的生命周期内受到限制甚至受到抑制，可以与FRET技术相结合，为分子结构（几何形状，距离，方向）和相关动态现象提供重要的见解。