蛋白质和其他硫醇化生物分子的马来酰亚胺标记

硫醇与马来酰亚胺的反应是广泛用于生物共轭和标记生物分子（包括蛋白质和肽）的过程。它按照以下方案进行：

马来酰亚胺是对硫醇表现出高选择性的亲电子化合物。虽然马来酰亚胺在自然界中几乎不存在，但硫醇却非常丰富。它们以半胱氨酸残基形式存在于蛋白质和肽中。尽管天然DNA不含硫醇，但具有硫醇基团的合成寡核苷酸可以很容易地制备。

硫醇易于氧化二聚并形成二硫键。因此，半胱氨酸残基形成二硫键，从而稳定蛋白质的三级结构。二硫化物不与马来酰亚胺反应。因此，有必要在缀合前还原二硫化物并排除反应中的氧气。

缀合方案取决于起始组分的溶解度。对于水溶性较低的化合物（如大多数荧光染料马来酰亚胺），必须使用有机共溶剂（如 DMSO或 DMF）。

我们建议采用以下方案将Lumprobe 染料马来酰亚胺与蛋白质、肽和其他硫醇化生物分子结合。

1. 将待标记的蛋白质或其他含有硫醇的分子溶解在塑料小瓶中的脱气缓冲液中，pH 7-7.5（PBS、Tris 和 HEPES 很好，但也可以使用其他不含硫醇的缓冲液）。可以通过在缓冲液上施加真空几分钟或通过惰性气体（氮气、氩气或氦气）鼓泡来对缓冲液进行脱气。对于蛋白质，最佳浓度为 1-10 mg/mL。

2. 添加过量的 TCEP（三羧乙基膦）试剂以减少二硫键，用惰性气体冲洗并关闭。 TCEP 过量 100 倍就可以了。将混合物在室温下放置 20 分钟。

3. 将马来酰亚胺染料溶解在 DMSO 或新鲜 DMF 中（100 uL 中 1-10 mg）。

4. 将马来酰亚胺染料溶液添加到硫醇溶液中（染料过量 20 倍），用惰性气体冲洗小瓶，然后紧紧关闭。

5. 充分混合并在 4°C 或室温下放置过夜。

6. 通过凝胶过滤、HPLC、FPLC 或电泳纯化产物。

对于水溶性差的马来酰亚胺，像大多数染料马来酰亚胺一样，我们建议使用共溶剂（DMF 或 DMSO）。具有良好水溶性的马来酰亚胺（如磺基-氰基马来酰亚胺）可以溶解在水中。如果出现沉淀，请增加混合物中有机助溶剂的含量，以实现更好的标记。

建议仅将透析作为纯化具有良好水溶性的马来酰亚胺的方法。