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396.35
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特点：
● 细胞、组织样品均可检测
● 操作更加简单
● 采用荧光法灵敏度更高
产品概述
丙二醛(MDA)是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物。因此，MDA 是检测细胞和组织中脂质过氧化物的最常见的指标之一，在氧化应激、铁死亡等领域的研究中被广泛使用。MDA Assay Kit 可以检测样品中的 MDA 浓度，通过硫代巴比妥酸（TBA）与水解产生的 MDA 反应形成的 TBA 复合体的吸光度或荧光强度来检测样品中的丙二醛（MDA）。试剂盒中配有抗氧化剂(Antioxidant)，可以防止样品在反应过程中发生不必要的氧化，从而确保获得准确的实验结果。
试剂盒内含
测定原理
本试剂盒采用经典的TBA法，通过检测MDA/硫代巴比妥酸(TBA)复合体的荧光或吸光度来检测细胞或组织中的MDA浓度。此外，试剂盒中还附带MDA标准溶液，以便通过标准曲线检测样品中的MDA。
产品特点
简化操作步骤
一般的MDA检测试剂盒(TBA法)，作为底物的硫代巴比妥酸(TBA)需要天平称量和高温加热溶解的步骤。而同仁化学研究所的MDA试剂盒中的TBA无需称量和加热溶解的操作，从而减少由于称量等造成的误差，使得实验结果的孔间差更小。同时，还可大幅缩短操作所需的时间。
细胞、组织样品均可检测
细胞样品通过荧光法检测。组织样品可以根据样品中MDA的含量在荧光法和吸光度法之间自由选择。具体可参考下表。
实验例
由于Erastin可以抑制xCT（胱氨酸/谷氨酸转运体），是最常见的铁死亡诱导剂之一。使用同仁化学研究所的MDA试剂盒检测Erastin处理的HepG2(人肝癌细胞)中MDA的变化。通过标准曲线(用BCA法蛋白定量校准后)，计算样品中MDA的浓度。可以发现，Erastin处理的细胞中，MDA含量明显上升。
产品文献
1、K. Igarashi, H. Iwai, K. Tanaka, Y. Kuwahara, J. Kitanaka, N. Kitanaka, A. Kurimasa, K. Tomita, T. Sato, “Neuroprotective effect of oxytocin on cognitive dysfunction, DNA damage, and intracellular chloride disturbance in young mice after cranial irradiation”, 2022, Biochem. Biophys. Res. Commun., doi:10.1016/j.bbrc.2022.04.099.
2、J. Zhu, X. Wang, Y. Su, J. Shao, X. Song, W. Wang, L. Zhong, L. Gan, Y. Zhao, X. Dong, “Multifunctional nanolocks with GSH as the key for synergistic ferroptosis and anti-chemotherapeutic resistance”, 2022, doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121704.
3、B. Yang, G. Joe, W. Li, Y. Shimizu, H. Saeki, “Comparison of Maillard-Type Glycated Collagen with Alginate Oligosaccharide and Glucose: Its Characterization, Antioxidant Activity, and Cytoprotective Activity on H2O2-Induced Cell Oxidative Damage”, 2022, doi:10.3390/foods11152374.
4、L. Dong, Z. Jiang, L. Yang, F. Hu, W. Zheng, P. Xue, S. Jiang, M. E. Andersen, G. He, M. J. C. Crabbe, W. Qu, “The genotoxic potential of mixed nitrosamines in drinking water involves oxidative stress and Nrf2 activation”, 2022, doi:10.1016/j.jhazmat.2021.128010.
5、C. Hou, L. Xiao, X. Ren, L. Cheng, B. Guo, M. Zhang, N. Yan., “EZH2-mediated H3K27me3 is a predictive biomarker and therapeutic target in uveal melanoma”, 2022, Front. Genet., doi:10.3389/fgene.2022.1013475.
6.Lizhong Yao, Junyi Hou, Xiongyan Wu, Yifan Lu, Zhijian Jin, Zhenjia Yu, Beiqin Yu, Jianfang Li, Zhongyin Yang, Chen Li, Min Yan, Zhenggang Zhu, Bingya Liu, Chao Yan, Liping Su，“Cancer-associated fibroblasts impair the cytotoxic function of NK cells in gastric cancer by inducing ferroptosis via iron regulation”，2023，Redox Biology，doi.org/10.1016/j.redox.2023.102923
6、Zixuan Yuan,ORCID,Xiaoming Zhou ,Yan Zou ,Bingtao Zhang ,Yao Jian ,Qi Wu ,Shujuan Chen and Xin Zhang“Hypoxia Aggravates Neuron Ferroptosis in Early Brain Injury Following Subarachnoid Hemorrhage via NCOA4-Meditated Ferritinophagy”，Antioxidants，2023，doi.org/10.3390/antiox12122097
关联产品
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特点：
● 即用型试剂盒、数据重现性好
● 配制试剂所需的时间大幅缩短
● 检测结果不易受pH, 溶剂等因素影响
规格性状
产品概述
近年来的研究发现，人体内的抗氧化能力的降低与各种疾病的产生息息相关，因此人们对于具有抗氧化能力的功能食品的需求越来越高。 根据日本高知大学岛村等人的文献报道 1)，使用稳定的自由基 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)作为底物的抗氧化能力检测法是数据重现性最好的一种方法。本试剂盒依据岛村老师的检测方法，将DPPH法的过程进行了改良和标准化，解决了以往实验中孔间差较大、试剂配制过程繁冗等问题。
本试剂盒在日本高知大学农林海洋学部的岛村智子老师的指导下开发而成 。
1) T. Shimamura et al., Anal. Sci., 2014, 30, 717-721
操作时间大幅缩短
DPPH和Trolox在溶液状态下都不稳定，需要现配现用。特别是作为底物的DPPH，一般还需要检测吸光度来确定含量，因此操作的步骤和时间都十分冗长。本试剂盒已经将所需的试剂准备好并分成小份单独包装，检测前只需要溶解定容即可开始实验，大幅缩短了操作步骤和时间。(DPPH的溶解需要超声波振荡发生器)
检测原理
检测步骤
将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。
将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。
检测结果不受各因素影响
用DPPH法检测抗氧化能力的时候，溶液中的pH以及溶剂的浓度等因素会对检测结果产生影响。本试剂盒通过优化操作步骤、调整溶液添加顺序等方法最大程度抑制pH和溶剂浓度对检测结果的影响。
pH对检测结果的影响 样品溶剂对检测结果的影响
试剂盒内含的Assay Buffer可以保证检测反应在一定 样品量只占检测溶液体积的1/10(20 μl)，因此样品的
的pH下进行。 溶剂无论是水还是无水乙醇，都不影响最终检测结果。
IC50值的复孔差
如果只用样品的抗氧化能力IC50值来评价，比较容易出现检测结果的波动。用标准物质(Trolox)和样品同时检测，通过Trolox等价活性值(TEAC)来评价的话，可以得到重现性高的检测结果。
TEAC（ μg TE/μg）= Trolox IC50 （μg/ml）/ Sample IC50（ μg/ml）
检测例
不同检测机构之间的检测结果的差异
下面3个不同的检测机构，使用本试剂盒检测已知的抗氧化物：没食子酸、儿茶酸、桑色素。用比色皿通过分光光度计检测Trolox等价活性值(TEAC)，结果显示3个检测机构之间的检测结果基本上没有差异。
参考文献：T. Shimamura et al., NipponShokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2007, 54, 482 – 487
分光光度计和酶标仪检测结果的一致性
按照上面的实验的同样的方法，改用酶标仪和96孔板进行检测并计算Trolox等价活性值(Trolox)，检测结果也高度一致。
参考文献
1、Enjuro Harunari, Chiaki Imada, Yasuhiro Igarashi, “Konamycins A and B and Rubromycins CA1 and CA2, Aromatic Polyketides from the Tunicate-Derived Streptomyces hyaluromycini MB-PO13T”, J. Nat. Prod., 2019, 82, (6), 1609-1615.
2、Hiroki Ishida, Naoki Yamasaki, Yuuki Otsuka, Daichi Mori, Tomoko Shimamura, Takuya Hasegawa, Shuhei Ogo, Tadaharu Ueda, “Electrochemical Antioxidant Capacity Measurement: A Downsized System and Its Application to Agricultural Crops”, Anal. Sci., 2021, doi:10.2116/analsci.21P217.
3、M. A. Maky and T. Zendo, “Generation and Characterization of Novel Bioactive Peptides from Fish and Beef Hydrolysates”, Appl. Sci., 2021, doi:10.3390/app112110452.
4、S. Kato, K. Kuwata, “Pro-/anti-oxidative properties of dopamine on membrane lipid peroxidation upon X-ray irradiation”, Radiat. Phys. Chem., 2021, doi:10.1016/j.radphyschem.2021.109518.
5、F. F. Sofian, N. Kikuchi, T. Koseki, Y. Kanno, S. Uesugi, Y. Shiono, “Antioxidant p-terphenyl compound, isolated from edible mushroom, Boletopsisleucomelas”, Biosci., Biotechnol., Biochem., 2022, doi:10.1093/bbb/zbab224.
6、S. Jin, S. Kim, D. S. Kim, D. Son and M. Shin, “Optically Anisotropic Topical Hemostatic Coacervate for Naked-Eye Identification of Blood Coagulation”, Adv. Funct. Mater., 2022, doi:10.1002/adfm.202110320.
7、Mohamed Abdelfattah Maky，Takeshi Zendo，“Identification of a Novel Bioactive Peptide Derived from Frozen Chicken Breast Hydrolysate and the Utilization of Hydrolysates as Biopreservatives“，Bioactive Peptides in Health and Disease【A special issue of Biology (ISSN 2079-7737).】，2023，doi.org/10.3390/biology12091218
FAQ
| Q：是否可以用涡旋振荡或者移液器吹打来溶解DPPH？ |
| A：由于DPPH较难溶解，无法用涡旋振荡或者移液器吹打完全溶解。溶解不充分是造成误差的原因，请务必用超声振荡完全溶解。 |
| Q：计算得到的IC50值的数据重现性不好，有哪些需要注意的地方？ |
| A：(1) 请确认DPPH Reagent在溶解时，管内是否有残留。
由于DPPH较难溶解，请务必使用超声振荡器充分溶解后再使用。特别需要注意管底部是否有残留。具体的判断方法请参照下图或操作说明书。
(2) 样品的稀释浓度间隔过大，或者抑制曲线已经达到饱和的情况下检测出来的IC50值，可能会有较大差距。因此，请务必做预实验，摸索最佳浓度范围。
|
| Q：每个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：<100 tests包装>
・每个试剂盒可以用于一块96孔板的检测 ・为了确保数据的准确性，建议至少设置3个复孔，下面按照复孔数为3计算可检测的样品数。 ・每个试剂盒的DPPH Reagent的量可以检测96孔板的100个孔。 (Blank 2和DPPH Reagent不需要添加，所以不计入孔数) 未知样品：可以检测1个样品 ・对于未知的检测样品，需要做预实验，每个试剂盒可以检测1个样品。 <预实验的孔数：确认最佳浓度范围> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) = 3 well <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度稀释系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) = 3 well *不需要预实验时，可以多检测一个样品。 已知IC50值大致范围的样品：可以检测3个样品 ・对于已知大致IC50值范围的样品，每个试剂盒可以检测3个样品。 对于不知道IC50值大致范围的未知样品，请按照操作步骤做预实验。 <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 3 (3个样品)= 72 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 12 well Blank：1 ( Blank 1) (n=3) = 3 well
<500 tests包装> ・每个试剂盒可以用于5块96孔板的检测（DPPH Reagent和Trolox Standard各5管） ・以下是500 tests包装可检测的样品数，100 tests包装请参考上面。 每个500 tests包装的试剂盒可以检测 (Blank 2和DPPH Reagent不需要添加，所以不计入孔数) 未知样品：可以检测8个样品 ・对于未知的检测样品，需要做预实验，每个试剂盒可以检测8个样品。 <预实验的孔数：确认最佳浓度范围> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 8 (8个样品) = 192 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) × 3 (3块板) = 9 well <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 8 (8块板) = 192 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度稀释系列) × 3 (3个复孔) × 5 (5块板) = 60 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) × 3 (3块板) = 9 well |
| Q：如果从开始反应到检测的时间间隔比较长，是否会影响检测值？ |
| A：如果反应时间过长，可能会影响检测结果。为了得到重现性高的检测数据，请严格按照操作说明书的步骤(25℃，30 min，避光)后，立即进行检测。检测多个孔板的时候，请保证各孔板的上机检测前的时间相同。 |
| Q：食品样品如果进行样品的前处理？ |
| A：关于食品样品的前处理方法，有下列检测实例供参考。<茶叶>
1) 取5 g 茶叶样品，加入50 ml 100℃的超纯水。 2) 在100℃下持续搅拌10 min。 3）10分钟搅拌后，用纱布过滤，并用超纯水将样品溶液调整至55 g。 4）将样品溶液转移至离心管，23℃，4000×g离心10 min。 5）用过滤膜(孔径0.45 μm)过滤上清液，制成样品溶液。
<青椒、红椒> 1) 将样品冻结干燥后用搅拌机打成粉末。 2) 取0.5 g粉末状的样品，添加2.5 g海砂和5 ml MWA提取溶剂。 (MWA溶剂的配制方法为 无水乙醇：超纯水：醋酸 = 90：9.5：0.5) 3) 搅拌10 s后，在超声波浴中37℃超声振荡5 min。 4) 23℃，1600×g离心10 min，回收上清。 5) 向沉淀物中再次加入5 ml MWA，重复步骤3，步骤4的操作3次。 6) 将所有回收得到的上清液加入25 ml容量瓶，用MWA定容作为检测样品。 |
| Q：如果样品有混浊，是否可以检测？ |
| A：<对于有混浊的样品>
样品中的混浊会影响检测结果。 我们尝试过用以下溶剂检测样品：水、无水乙醇、甲醇、WMA、DMSO。 *MWA溶剂的配制方法为 无水乙醇：超纯水：醋酸 = 90：9.5：0.5 *DMSO可能会造成TEAC值偏高。 如果样品不能完全溶解，仍然有混浊时，请将样品过滤后再使用。 混浊部分的抗氧化能力无法检测。 如果溶剂是水，还可以用SOD Assay Kit-WST检测。 由于DPPH的检测原理与SOD试剂盒的原理不同，可以用双指标进行验证。 另外，含有大量胡萝卜素的样品或者溶液呈紫色的样品不适用本试剂盒检测。 推荐用其他方法检测。 |
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氧化应激与自由基
品名货号用途
| Glutamine Assay Kit-WST试剂盒 | G268 | 谷氨酰胺的定量检测 |
| Glutamate Assay Kit-WST试剂盒 | G269 | 谷氨酸的定量检测 |
细胞中的氧化应激是由代谢、电离辐射和与DNA直接相互作用的致癌化合物产生的ROS导致的。在代谢的过程中，小部分的氧由于一个电子的还原变成超氧阴离子，接着超氧阴离子被超氧化物岐化酶 (SOD) 转变成氧气和过氧化氢。过氧化氢由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶还原成水。然而如果过氧化氢并没有被这些酶完全还原，当它被铁(Fenton反应)氧化将产生反应性极强的羟自由基。羟自由基还可以由紫外线照射产生或直接电离辐射水产生。羟自由基可以与脂反应产生脂质过氧化物。然而并非所有ROS都是有害的。次氯酸盐离子是一种由中性粒细胞的髓过氧化物酶产生的过氧化氢衍生而来的ROS，它具有杀菌活性。NO也称为内皮来源的舒张因子，它是由NO合成酶产生的。不过NO和超氧阴离子反应可产生具有细胞毒性的过氧亚硝基阴离子。ROS和活性氮化合物在生物系统中具有许多不同的活性。相应地好氧生物会产生防止氧化应激的防御机制。最近在对防御机制以及氧化损伤与疾病或老化过程之间关系的研究中，氧化应激已成为许多研究的焦点。最终已发展出许多用于检测ROS相关或ROS来源的物质的方法，这些物质包括超氧阴离子、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、DNA损伤、8-氧基鸟嘌呤、8-硝基鸟嘌呤和蛋白质羰基等。
