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同仁化学Cellstain- PI solution试剂货号：P378 CAS号：25535-16-4| 日本DOJINDO

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3,8-二氨基-5-[3-(二乙基家氨基)丙基]-6-苯基啡啶二碘，水溶液（3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide,aqueous solution）
CAS号：25535-16-4
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C27H34I2N4

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Cellstain- PI solution试剂货号：P378 CAS号：25535-16-4

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同仁化学Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542 活死细胞双染试剂盒| 日本DOJINDO

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542
活死细胞双染试剂盒
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
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细胞染色

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542 活死细胞双染试剂盒

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542 活死细胞双染试剂盒

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荧光特性
染色例
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操作步骤
注意事项
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试剂盒内含

                                                                     500 次            3000 次

・Calcein-AM Reagent                             200 μg x 1        1 mg x 1

・PI Stock Solution (1.5 mmol/l)              200 μl x 1         1 ml x 1

・DMSO                                                    200 μl x 1         1 ml x 1

产品概述

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒内含两种染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团，产生的Calcein (钙黄绿素) 发出强绿色荧光，因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，因此死细胞会被检测到红色荧光。除了用荧光显微镜外，也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。

荧光特性

Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm

PI : λex=530 nm , λem=580 nm

染色例

                                                                           细胞染色实例

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542 活死细胞双染试剂盒

（a）                                     （b）                                      （c）

a)  Calcein-AM染FTC细胞（活细胞单染）

b)  PI染HCT116细胞（死细胞单染）

c)  Calcein-AM、PI染MHD-1 细胞（活死细胞双染）

最佳浓度摸索

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。

Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度：

1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。

2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

操作步骤

以HeLa细胞为例

制备1 mmol/l的Calcein-AM储存液

【500 次】

将200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

【3000 次】

将1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

※Calcein-AM储存液需要避光，在-20℃密封保存。

 

制备染色工作液

将Calcein-AM储存液和PI储存液恢复至室温后使用。

在5 ml的PBS（-）中加入10 μl Calcein-AM储存液和15 μl PI储存液，混匀制成工作液。此时Calcein-AM的浓度为2 μmol/l，而PI的浓度为4.5 μmol/l。

 

染色步骤

1、 用Trypsin-EDTA消化细胞。

2、 通过离心收集细胞（1,000 rpm，3 min）。

3、 去除上清液，加入PBS（-）制备细胞悬液（105 – 106 cells/ml为宜）。

4、 重复步骤2和步骤3数次以消除培养基中的酯酶活性。

5、 取100 μl 染色工作液与200 μl 细胞悬液混合，在37℃培养15 min。

6、 在490±10 nm激发波长下同时观察黄绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞。另外用545 nm激发波长单独观察死细胞。

注意事项

1、 由于本试剂盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先涡旋以使其振落下来。

2、 由于Calcein-AM储存液对潮气敏感，请在使用后密闭Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成10 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

3、 配制好的染色工作液请在当天使用。

4、 PI有疑似致癌性，使用前应注意以下几点：

1） 使用时请带好手套，口罩，防护眼镜等，不要接触到或呼吸到。

2） 当PI不慎接触到皮肤时，请立刻用大量的水冲洗。

3） 处理方法

清洗容器的清洗液和废液请按照实验室的有毒有害物质的处理方法进行处理，或按照以下方法处理：

・用UV照射的方法进行分解

・用次氯酸钠氧化分解后，进行中和处理

参考文献

1. A novel photothermally controlled multifunctional scaffold for clinical treatment of osteosarcoma and tissue regeneration,

Materials Today, 2020, doi.org/10.1016/j.mattod.2019.12.005

2. Mitochondria-Targeted Artificial “Nano-RBCs” for Amplified Synergistic Cancer Phototherapy by a Single NIR Irradiation,

Advanced Science, 2018, 5, 1800049

3. 4D-Printed Biodegradable and Remotely Controllable Shape Memory Occlusion Devices,

Advanced Functional Materials, 2019, 29(51), 1906569

4. Magnetic Hyperthermia-Synergistic H2O2 Self-Sufficient Catalytic Suppression of Osteosarcoma with Enhanced Bone-Re

generation Bioactivity by 3D-Printing Composite, Advanced Functional Materials, 2019, 1907071

5. A Substitution-Dependent Light-Up Fluorescence Probe for Selectively Detecting Fe3+ Ions and Its Cell Imaging Application,

Advanced Functional Materials, 2018, 28(35), 1802833

6. An Extendable Star-Like Nanoplatform for Functional and Anatomical Imaging-Guided Photothermal Oncotherapy,

ACS Nano, 2019, 13(4), 4379-4391

7. Near-Infrared Light-Triggered Sulfur Dioxide Gas Therapy of Cancer, ACS Nano, 2019, 13(2), 2103-2113

8. Nanoenzyme-Augmented Cancer Sonodynamic Therapy by Catalytic Tumor Oxygenation,

ACS Nano, 2018, 12(4), 3780-3795

9. Terrylenediimide-Based Intrinsic Theranostic Nanomedicines with High Photothermal Conversion Efficiency for Photoacoustic

Imaging-Guided Cancer Therapy, ACS Nano, 2017, 11(4), 3797-3805

10. Two-Dimensional Graphene Augments Nanosonosensitized Sonocatalytic Tumor, ACS Nano, 2017, 11(9), 9467-9480

11. Multifunctional Bismuth Selenide Nanocomposites for Anti-Tumor Thermo-Chemotherapy and Imaging,

ACS Nano, 2016, 10(1), 984-97

12. Molecular Responses of Human Lung Epithelial Cells to the Toxicity of Copper Oxide Nanoparticles Inferred from Whole

Genome Expression Analysis, ACS Nano, 2011, 5(12), 9326–9338

13. Living functional hydrogels generated by bioorthogonal cross-linking reactions of azidemodified cells with alkyne-modified

polymers, Nature Communications, 2018, 9, 2195

14. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds,

Nature Communications, 2019, 10(1), 2060

15. Magnetic-responsive and targeted cancer nanotheranostics by PA/MR bimodal imaging-guided photothermally triggered

immunotherapy, Biomaterials, 2019, 219, 119370

16. Oriented collagen fiber membranes formed through counter-rotating extrusion and their application in tendon regeneration,

Biomaterials, 2019, 207, 61-75

17. Triple-functional polyetheretherketone surface with enhanced bacteriostasis and anti-inflammatory and osseointegrative

properties for implant application, Biomaterials, 2019, 212, 98-114

18. Ultrasmall Cu2-xS nanodots as photothermal-enhanced Fenton nanocatalysts for synergistic tumor therapy at NIR-II

biowindow, Biomaterials, 2019, 206, 101-114

19. Theranostic 2D ultrathin MnO2 nanosheets with fast responsibility to endogenous tumor microenvironment and exogenous

NIR irradiation, Biomaterials, 2018, 155, 54-63

20. Cooption of heat shock regulatory system for anhydrobiosis in the sleeping chironomid Polypedilum vanderplanki,

Proc. Natl. Acad. Sci., 2018, 115(10), E2477-E2486

21. Wnt Inhibitor Dickkopf-1 as a Target for Passive Cancer Immunotherapy,

Cancer Research, 2010, 70(13), 5326-36

22. Gadolinium polytungstate nanoclusters: a new theranostic with ultrasmall size and versatile properties for dual-modal MR/CT

imaging and photothermal therapy/radiotherapy of cancer, NPG Asia Material, 2016, 8, e273

23. 2D Superparamagnetic Tantalum Carbide Composite MXenes for Efficient Breast-Cancer Theranostics,

Theranostics, 2018, 8(6), 1648-1664

24. Connexin43 Hemichannels Contribute to Cadmium-Induced Oxidative Stress and Cell Injury,

Antioxidants & Redox Signaling, 2011, 14(12), 2427-39

25. Synthesis and characterization of hierarchically macroporous and mesoporous CaO-MO-SiO2-P2O5(M=Mg,Zn,Sr) bioactive

glass scaffolds, Acta Biomaterialia, 2011, 7(10), 3638-3644

同仁化学Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297| 日本DOJINDO

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Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297
氧消耗量检测试剂盒
Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：常温

特点：

 

● 适用于普通荧光酶标仪

● 不需要昂贵的仪器、特殊介质和孔板

● 带OCR计算表的一体式试剂盒

 

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现货

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

产品解说
产品规格
OCR计算器
OCR是线粒体功能的重要指标
产品概述
与现有方法比较
与石英分析仪对比
实验例：抑制线粒体电子传输链
实验例：细胞最大呼吸能力评估
实验例：不同细胞系代谢途径依赖性的比较
Q&A
参考文献

产品解说

 

产品规格

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

OCR计算器

 

OCR是线粒体功能的重要指标

由于氧主要在线粒体氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）的过程中消耗，因此其耗氧率（OCR）是分析线粒体功能的指标。众所周知，癌细胞通过糖酵解途径产生ATP，其效率低于氧化磷酸化。在免疫细胞中，氧化磷酸化的优势是抑制抗肿瘤，而糖酵解途径的优势促进抗肿瘤作用。因此，细胞的OCR作为能量代谢的检测指标。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

产品概述

细胞外氧消耗量试剂盒包括氧气探针，其具有随着介质中氧气浓度的降低而增加荧光强度的特性，矿物油阻止氧气从空气中流入。

在用荧光酶标仪根据细胞外氧浓度测量荧光强度之后，根据Stern-Volmer方程计算细胞的OCR（自动计算表）。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

*该产品在群马大学Toshitada Yoshihara博士的指导下实现了产品化。

与现有方法比较

到目前为止，OCR测量需要昂贵的设备，如通量分析仪，实时动态检测酶标仪，以及酶标仪的功能调节。该试剂盒推荐给初此使用的人，因为它可以与常规荧光酶标仪一起使用，并附带所有必要试剂的完整包装。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

与石英分析仪对比

石英分析仪（XFe24）和本试剂盒在相同条件下（细胞类型、细胞数量和FCCP浓度）进行测量。

得到XFe24与本试剂盒相关氧消耗速度变化的数据。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

细胞种类: HepG2

细胞数: 5×10⁴ cells/well

试剂: FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)

FCCP 浓度: 2 μmol/l

实验例：抑制线粒体电子传输链

用抗霉素刺激大鼠细胞，评估线粒体电子运输链抑制后细胞状态的变化，检测多种指标。

结果表明，电子传输链的抑制导致（1）线粒体膜电位的降低和（2）OCR的降低。此外，观察到（3）整个糖酵解途径的NAD+/NADH比率降低，这是由于丙酮酸到乳酸的代谢增加，以维持糖酵解通路；（4）由于活性氧（ROS）增加，GSH耗竭；（6）由于谷胱甘肽生物合成所需NADPH减少，NADP+/NADPH比率增加。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

实验例：细胞最大呼吸能力评估

在HepG2细胞中，通过FCCP刺激后OCR值的变化来评估细胞的最大呼吸。

在FCCP浓度分别2µmol/l和4µmol/l 测量OCR。与2µmol/l相比，在4µmol/l时观察到OCR降低，表明在2µmol/l FCCP时最大呼吸。
Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

 

细胞: HepG2

细胞数: 5×104 cells/well

试剂: FCCP

FCCP 浓度 2, 4 μmol/l

实验例：不同细胞系代谢途径依赖性的比较

    许多癌症细胞通过糖酵解途径产生ATP。另一方面，最近有报道称，糖酵解途径被抑制的癌症细胞，可通过增强线粒体功能将能量代谢转移到OXPHOS而达到存活的目的，代谢途径的依赖性因细胞系不同而异。

基于乳酸生成、ATP水平和OCR值，比较了两种癌症细胞HeLa和HepG2中OXPHOS和糖酵解的依赖性关系。

＜通过乳酸生产和ATP水平进行评估＞

我们证实了当寡霉素刺激和糖酵解途径中的 2-Deoxy-D-glucose（2-DG）抑制OXPHOS的ATP合成时，ATP和乳酸产生的变化。结果表明，HeLa细胞依赖于糖酵解，HepG2细胞依赖于OXPHOS合成ATP。

*有关结果的更多信息，请参下方的“所用技术和产品的补充信息”部分。

所用技术和产品的补充信息
＜通过乳酸产生和ATP的量进行评估＞

当OXPHOS在HeLa细胞中被抑制时，ATP水平保持不变（①），乳酸产生增加（②）。这表明，即使OXPHOS被抑制，糖酵解也可以被进一步激活。相反，当糖酵解被抑制时，ATP水平显著降低（③），表明能量的产生依赖于糖酵解。另一方面，当OXPHOS在HepG2细胞中被抑制时，乳酸的产生增加（④），表明细胞试图通过增强糖酵解来补偿能量的产生，但ATP水平仍然降低（⑤）。这意味着，即使糖酵解增加，ATP的产生也没有得到足够的代偿。此外，当糖酵解被抑制时，ATP水平下降更多（⑥），这表明HepG2细胞的能量产生更多地依赖于OXPHOS而不是糖酵解。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

本数据同时使用了：糖酵解/氧化磷酸化检测试剂盒—Glycolysis/OXPHOS Assay Kit（G270）

＜OCR值评估＞

使用相同数量的细胞，我们测量了当用线粒体解偶联剂FCCP刺激细胞来促进细胞耗氧量时的OCR值。结果表明，HepG2细胞比HeLa细胞具有更高的OCR值，这表明对OXPHOS的依赖性更强，这与ATP水平和乳酸产生的结果有关。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

〈实验条件〉

细胞系：HeLa、HepG2

细胞数：5×104个细胞/孔

刺激：FCCP

浓度：2μmol/l

使用：Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒（货号：E297）进行评估

Q&A

Q:本试剂盒可以检测多少样本？
A:当测试一种细胞类型的相同数量的细胞时，可以测量24个样品。

*如果实验中使用了两种以上的细胞类型或多个细胞编号，则必须准备单独的空白和对照，并且可以测量的样本数量会有所不同。

有关详细信息，请参考手册中的板布局示例。
Q:悬浮细胞有什么实验案例吗？
A:我们准备了一个大鼠细胞实验的例子。＜说明＞

（1） 将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬浮于RPMI培养基中作为空白3，将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬于工作溶液中作为对照或样品。将细胞接种在100µl（300000个细胞/孔）的96孔黑色透明底部微孔板中。

 

（2） 向空白1中加入100µl RPMI培养基，向空白2中加入100μl工作溶液。

 

（3） 将微孔板放置在预先设定为37°C的读板器中，孵育30分钟。

 

（4） 向空白1、空白2、空白3和对照品中加入10µl RPMI培养基。

 

（5） 将用RPMI培养基稀释的样品溶液（抗霉素或FCCP溶液）分10µl加入样品中。

 

（6） 加入样品溶液后，立即向每个孔中加入一滴矿物油。

 

（7） 将微板放置在37°C的平板读数器中，孵育5分钟。

 

（8） 在一个时间过程中，用荧光板读取器每10分钟测量一次强度，持续200分钟（Ex:500nm，Em:650nm，底部读数）。

（9） OCR值通过将获得的强度值输入下载的专用Excel计算表来计算。

每孔所需的样品和试剂数量。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297
Q:如何使用此试剂盒计算OCR？
A:请使用Excel计算表并遵循以下说明

 

＜OCR计算程序概述＞

（1） 将OCR测量获得的强度值输入计算表，使用Stern-Volmer公式自动计算氧含量（nmol）。

（2） 根据时间（min）与氧含量（nmol）的关系图，检查所有测量条件下获得的线性范围。

（3） 计算步骤（2）中确认的时间（min）和氧含量（nmol）范围内的斜率。

（4） 根据步骤（3）中计算的斜率计算OCR（pmol/min）。

有关详细信息，请参阅手册中的“分析”。

*需要计算OCR的客户请至【网站首页】-【技术支持】-【实验工具】即可找到OCR计算器

 

Q：矿物油对细胞有细胞毒性吗？
A： 当通过Cell Counting Kit-8细胞毒性测定测定时，在用矿物油处理的细胞中未观察到毒性。

 

Q：为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪？
A： 在添加试剂和矿物油后，将微孔板与培养箱（或加热块、恒温室等）一起孵育，酶标仪中的温差将影响OCR结果。这导致数据再现性下降。因此，请使用温度可控的酶标仪。

＜常规操作＞

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

步骤3、7用于悬浮细胞，步骤5、9用于贴壁细胞

＜孵育环境对结果的影响＞

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297
Q：OCR检测后如何测量细胞数？
A：使用核酸探针（代码：H342）Hoechst 33342测量每个孔的细胞数，这是该方案的一个示例。

＜说明＞

（1） 将细胞接种到孔中进行OCR测量（液体体积：100μl/孔）。

（2） 将制备校准曲线的细胞接种到孔中（液体体积：100μl/孔）。

（3） OCR根据说明书进行测量。

（4） 向孔中加入10µl/孔的介质进行校准（使介质体积与OCR测量孔的体积对齐至110µl/孔）。

（5） 将用培养基稀释的Hoechst 33342溶液（10µg/ml）以100µl/孔的速度添加到所有孔中。

*从油的顶部添加OCR测量孔。

（6） 在37°C下培养30分钟。

（7） 用荧光板读数器（Ex:350nm，Em:461nm）测量。

（8） 制备校准曲线（X轴：细胞数量，Y轴：荧光强度），并计算用于OCR测量的孔中的细胞数量。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297
Q：可以长期存储工作液吗
A 工作液不能储存，需要现配现用。
Q：氧探针或矿物油的反复冷冻和解冻是否会影响测定？
A 我们已经证实，氧气探针和矿物油的反复冻融循环对测定没有影响。
Q：对照组与实验组之间OCR没有差异，有哪些可能得原因？
A请检查以下两个实验条件。

（1） 如果在测量过程中温度发生变化，可能会影响OCR结果。请确保以下两个步骤完全按照说明书执行。

・矿物油、溶剂和稀释溶剂等溶液在使用前应预热至37°C左右。

・加入试剂和矿物油后，请使用温度可控的酶标仪进行孵育。

请参阅Q&A“为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪？”。

（2） 建议在最终计算前，优化单元格数据。如果细胞数量较低，实验组和对照组之间的差异也可能并不显著。

【带有细胞数和试剂处理的OCR值（预期结果图）】

 

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号：E297

参考文献

 

文献 研究对象 引用文献
1 细胞(HepG2) K.Saito.et al“Obesity-induced metabolic imbalance allosterically modulates CtBP2 to inhibit PPAR-alpha transcriptional activity”2023，Journal of Biological Chemistry，doi.org/10.1016/j.jbc.2023.104890
2 细胞（NIH3T3-L1） S. Oki, S. Kageyama, Y. Morioka and T. Namba, “Malonate induces the browning of white adipose tissue in high-fat diet induced obesity model”, Biochem Biophys Res Commun., 2023, doi:10.1016/j.bbrc.2023.08.054.
3 细胞

(Primary Hepatocyte）

 S. Tsuno, K. Harada, M. Horikoshi, M. Mita, T. Kitaguchi, M. Y. Hirai, M. Matsumoto and T. Tsubo , ‘Mitochondrial ATP concentration decreases immediately after glucose administration to glucose-deprived hepatocytes’, FEBS Open Bio, 2023, doi:10.1002/2211-5463.13744.
  4 精子 “Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage”, Scientific Reports , 2023 , doi: 10.1038/s41598-023-48550-2.
5 细胞(HepG2) Takeo Nakanishi.et al“An implication of the mitochondrial carrier SLC25A3 as an oxidative stress modulator in NAFLD“Experimental Cell Research.,2023,431,113740

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Sulfo-AC5-SPDP试剂货号：S359
N-{6-[3-(2-Pyridyldithio)propionamido]hexanoyloxy}sulfosuccinimide, sodium salt
169751-10-4
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮
运输条件：室温
分子式：

C18H22N3NaO8S3

分子量：

527.57

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IgG纯化分离

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ICG Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK31
ICG 标记试剂盒-氨基
ICG Labeling Kit – NH2
商品信息
储存条件：0-5度保存,防潮
运输条件：室温

特点：

● 标记的物质可以在大约2个小时内制备。

● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

● 可以标记50至200μg的蛋白质。

● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

● 标记的物质可以用所附的保存溶液保存。

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3samples

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蛋白抗体标记检测方案

ICG Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

试剂盒内含
产品概述
原理
操作步骤
产品优势
ICG标记实验例
荧光特性
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

ICG Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

产品概述

ICG（吲哚菁绿）是一种花青颜料，也用于肝功能和肝储备测试的色素负载测试中，并且在近红外区域具有荧光。激发波长在774nm附近，荧光波长在805nm附近，并且具有即使在体内使用也不容易被血红蛋白干扰的荧光特性。因此，期望将其应用于使用近红外荧光的体内荧光成像。 ICG标记试剂盒-NH2是用于标记具有氨基基团的蛋白质（尤其是抗体）的试剂盒。套件随附的NH2-Reactive以及已发布的荧光素标记套件–NH2（代码：LK01），HiLyte FluorTM 555标记套件–NH2（代码：LK14），HiLite FluorTM 647标记套件–NH2（代码：LK15）由于ICG在分子中具有活性酯，因此仅通过与具有氨基的分子混合即可形成稳定的共价键。当将ICG标记在蛋白质上时，可以使用随附的过滤管轻松去除抑制标记反应和未反应的NH2反应性ICG的低分子量化合物（例如Tris）。对于ICG标记的IgG，荧光波长为774/805nm。

该试剂盒包含标记所需的试剂和用于储存准备好的ICG标记产品的溶液。

原理

ICG Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

操作步骤

使用注意事项:

如果样品中含有分子量>10,000的物质 (多肽、其它蛋白等)，有阻碍标记反应的可能性。在标记前需要先纯化，如果样品是抗体，可用 IgG Purification Kit (AP01，AP02)纯化，如果样品中有小的不溶物质，离心后取上清液来标记。

操作步骤：

ICG Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

a) 蛋白溶液量要≤100ul，如果抗体浓度<0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总蛋白量达到50-200ug。

b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，继续离心5min或提高转速。

c) NH2-Reactive ICG在管子的底部，加10ul DMSO到管子的底部，用移液器反复吹打溶解。由于NH2-Reactive ICG会被DMSO中的水分水解，在制备好NH2-Reactive ICG溶液后马上进行第4步操作。

d) 如果蛋白总量达到200ug，请加入全部NH2-Reactive ICG溶液。

e) 我们推荐用WS Buffer保存标记产物，但也可以根据下一步实验要求选择合适的缓冲液。

产品优势

1）标记的物质可以在大约2个小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）标记的物质可以用所附的保存溶液保存。

ICG标记实验例

图. 小鼠尾静脉注射ICG抗体的荧光成像图小鼠皮下肿瘤模型在注射了ICG抗体 (50ug) 48h后，有明显的迹象表明抗体在肿瘤中有选择性地聚集。

ICG Labeling Kit &#8211; NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

仪器：活体成像仪 (Clairvivo OPT，岛津制作所)

小鼠：BALB/c(nu/nu) 纯合子裸小鼠 (母，11周)

肿瘤细胞：HeLa细胞 (在右腋皮下移植后4周)

检测条件：Ex=785nm，Em=845/55nm

抗体：整合素α2抗体 曝光时间：10s

荧光特性

ICG Labeling Kit &#8211; NH2试剂盒货号：LK31 ICG 标记试剂盒-氨基

常见问题Q&A

Q1: 标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。

当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。

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PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33

PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33

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离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。

参考文献

1) M.   Ogawa, C. A. S. Regino, J. Seidel, M. V. Green, W. Xi, M. Williams, N.   Kosaka, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “Dual-Modality Molecular Imaging   Using Antibodies Labeled with Activatable Fluorescence and a Radionuclide for   Specific and Quantitative Targeted Cancer Detection”, Bioconjugate   Chem., 2009, 20(11), 2177.
2) M. Ogawa, N. Kosaka, P. L.   Choyke and H. Kobayashi, “In vivo Molecular Imaging of Cancer with a   Quenching Near-Infrared Fluorescent Probe Using Conjuates of Monoclonal   Antibodies and Indocyanine Green”, Cancer Res., 2009, 69(4), 1268.
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8) S. Ito, N. Muguruma, S.   Hayashi, S. Taoka, T. Bando, Y. Kusaka, M. Yano, S. Ichikawa, A. Hiasa, T.   Omoya, H. Honda, I. Shimizu, K. Ii, K. Nakamura, K. Takesako, Y. Goto and S.   Shibamura, “Visualization of Human Gastric Cancer with a Novel Infrared   Fluorescent Labeling Marker of Anti-carcinoembryonic Antigen Antibody in   vitro”, Dig. Endosc., 2000, 12, 33.
9) S. Taoka, S. Ito, N.   Muguruma, S. Hayashi, Y. Kusaka, K. Ii, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako   and S. Shibamura, “Reflected Illumination-type Imaging System for the   Development of Infrared Fluorescence Endoscopy”, Dig. Endosc.,1999, 11(4),   321.
10) S. Ito, N. Muguruma, S.   Hayashi, S. Taoka, A. Tsutsui, T. Fukuda, T. Okahisa, Y. Ohkita, H.   Matsunaga, I. Shimizu, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako and S.   Shibamura,”Development of an Imaging System Using Fluorescent Labeling   Substances Excited by Infrared Rays”, Dig. Endosc., 1997, 9, 278.
11) S. Ito, N. Muguruma, Y. Kusaka, M.   Tadatsu, K. Inayama, Y. Musashi, M. Yano, T. Bando, H. Honda, I. Shimizu, K.   Ii, K. Takesako, H. Takeuchi and S. Shibamura, “Detection of Human   Ganstric Cancer of Resected Specimens Using a Novel Infrared Fluorescent   Anti-Human Carcinoembryonic Antigen Antibody with an Infrared Fluorescence   Endoscope in Vitro”, Endoscopy, 2001, 33(10), 849.
12) N. Muguruma, S. Ito, T.   Bando, S. Taoka, Y. Kusaka, S. Hayashi, S. Ichikawa, Y. Matsunaga, Y. Tada,   S. Okamura, K. Ii, K. Imaizumi, K. Nakamura, K. Takesako and S. Shibamura,   “Labeled Carcinoembryonic Antigen Antibodies Excitable by Infrared Rays:   a Novel Diagnostic Method for Micro Cancers in the Digestive Tract”,   Internal Medicine, 1999, 38(7), 537.
13) T. Bando, N. Muguruma, S.   Ito, Y. Musashi, K. Inayama, Y. Kusaka, M. Tadatsu, K. Ii, T. Irimura, S.   Shibamura and K. Takesako, “Basic Study on a Labeled anti-mucin Antibody   Detectable by Infrared-fluorescence Endoscopy”, J. Gastroenterol., 2002,   37, 260.
14) N. Muguruma, S. Ito, S.   Hayashi, S. Taoka, H. Kakehashi, K. Ii, S. Shibamura and K. Takesako,   “Antibodies Labeled with Fluorescence-agent Excitable by Infrared   Rays”, J. Gastroenterol., 1998, 33, 467.
15) 伊藤進,   六車直樹,“不可視情報の画像化－新しい内視鏡診断学の展望 (5)赤外蛍光を用いた微小癌診断”,　臨牀消化器内科, 1999, 14(8), 1205.
16) W. Aung, A. Tsuji, H.   Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga,   “Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed   Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer   Model”, Molecular Imaging, 2016, 15, 1.