细胞解离试剂的选购

我们全面的细胞解离试剂产品线包括：

• 胰蛋白酶：用于常规细胞分离的动物来源、重组型和StableCell 胰蛋白酶

• 胰蛋白酶-EDTA和EDTA溶液

• ECM特异性胶原酶、弹性蛋白酶、分散酶

• Accumax和Accutase非酶溶液

胰蛋白酶，重组胰蛋白酶，STABLECELL™胰蛋白酶

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，是常用的贴壁细胞系和组织解离酶之一。粗制胰蛋白酶制剂通常同时适用上述两种应用，但胰蛋白酶浓度过高或细胞孵育时间过长时，可能会损伤细胞膜并杀死细胞。从培养基质上解离培养细胞的常用方法是联合使用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸）处理，其中胰蛋白酶浓度范围为0.025%至0.5%。

和标准胰蛋白酶溶液一样，StableCell 胰蛋白酶溶液专用于细胞解离，但无需分液、冷冻和解冻。由于不再需要分液及等待胰蛋白酶解冻，此溶液为细胞传代或相关实验节省了大量时间，也腾出了更多宝贵的实验室冷柜空间。建议2-8 °C储存我们的StableCell™胰蛋白酶溶液，但我们自己开展的研究证明，37 °C储存的StableCell™胰蛋白酶仍可保留>90%的活性和性能。

胶原蛋白酶和分散酶

胶原蛋白酶可切割天然三螺旋胶原蛋白中的肽键。由于具有水解天然胶原蛋白的能力，其广泛用于动物组织细胞分离。胶原蛋白酶存在于多种微生物和不同的动物细胞中。胶原蛋白酶是由厌氧细菌溶组织梭状芽孢杆菌分泌的“粗制”胶原酶。

分散酶是一种快速、有效、温和且中性的蛋白酶，可培养物中的完整上皮薄层与基质的。分散酶I用于消化肺组织和处理细胞，适用于流式染色和鼠CD4 T细胞的分离。

特殊培养物解离试剂

针对需要更为温和酶活性的细胞和组织，可采用浓度更低、效率更高的Accumax和Accutase酶溶液酶溶液解离或分离。上述溶液：

• 可有效分离胚胎和神经干细胞

• 解离温和，可保留细胞活力并增加细胞产量

• 无需中和

cytion细胞培养解离技术概述

细胞培养物解离是细胞培养物维持的关键步骤。它涉及将细胞从其生长表面分离以进行传代培养或收获。本节概述了两种主要方法：使用无酶解离缓冲液和使用酶试剂。

1. 使用无酶细胞解离缓冲液

该方法非常温和，无需使用酶即可保持细胞完整性：

1. 准备

• 确保所有试剂在使用前加热至 37°C，以避免对细胞造成冲击。

2. 去除生长培养基：

• 从培养容器中丢弃旧的生长培养基。

3. 漂洗

• 每个 T75 烧瓶或 100 mm 培养皿用 5 ml 不含钙和镁的 PBS 冲洗细胞单层。

• 在室温下轻轻摇动容器 30 至 60 秒。

• 吸出并丢弃冲洗溶液。

• 再次重复此冲洗步骤。

4. 解离

• 将大约 5 ml 无酶细胞解离缓冲液添加到容器中。

• 在室温下轻轻摇动 1 至 2 分钟，然后在显微镜下检查解离情况。

• 如有必要，用手轻敲烧瓶或培养皿以去除细胞。

• 如果细胞贴壁，让它们在室温下再静置 2 至 5 分钟，并根据需要再次敲击，使用更多的解离缓冲液。

• 细胞分离后，添加至少 5 ml 全生长培养基以中和解离缓冲液并重悬细胞。

5. 活力检查

• 在传代培养过程中监测细胞活力，确保其保持在 90% 以上。

2. 使用其他试剂进行解离

该方法允许使用各种解离试剂：

1. 去除用过的介质

• 丢弃培养容器中的旧介质。

2. 洗涤细胞

• 用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞，或使用 EDTA。

• 将洗涤液轻轻添加到细胞对面，并摇动容器 1 至 2 分钟，然后丢弃洗涤液。

3. 解离

• 每 25 平方厘米的生长表面涂抹 2 至 3 毫升所选的解离溶液，确保覆盖细胞片层。

• 将容器在 37°C 下孵育并轻轻摇动。解离通常发生在 5 至 15 分钟内，具体取决于细胞系。

• 对于顽固的细胞，敲击容器可以加快这一过程。

• 仔细观察细胞以防止过度暴露和潜在的损坏。

4. 收获细胞

• 一旦细胞分离，将其直立，让它们收集在容器底部。

• 添加完整的培养基，然后通过移液到细胞层上分散并收集细胞。

• 计数并继续传代。

在这两种方法中，重要的是通过经验观察确定每个细胞系的最佳条件。该过程应保留细胞活力，在传代培养过程中应定期检查细胞活力是否超过 90%。这些程序为研究人员根据其细胞系的具体要求和特征进行调整奠定了基础。

成功传代的方法——解离法

在开发特定细胞系的培养条件时需要考虑许多参数。我们都知道 pH 平衡、氧气水平和血清浓度是影响培养成败的重要变量。然而，包括与细胞需求相匹配的解离方法的传代方案也同样重要。考虑到这一点，我们将回顾一些常见解离实践背后的原则，以帮助您根据细胞系的具体性质定制方法。

悬浮生长的细胞易于传代培养。只要在细胞耗尽营养供应之前将细胞稀释到合适的新鲜培养基中，它们就会表现得很好。另一方面，单层生长的细胞彼此之间以及与培养皿之间形成蛋白质接触。在将细胞悬浮在培养基中、离心并重新铺板之前，必须先将这些物质破坏。因此，必须特别考虑以确保解离条件破坏细胞接触而不杀死细胞。

胰蛋白酶有时（但并非总是）是答案

在决定解离条件时，研究者应考虑细胞形成的键的类型。一些贴壁细胞系仅形成微弱的接触，只需将培养瓶敲击手掌或将培养瓶敲击台面即可破坏接触。其他贴壁细胞系，特别是那些源自上皮的细胞系，会形成牢固的多蛋白紧密连接，只能通过酶消化来破坏；在这些情况下，通常使用胰蛋白酶（一种丝氨酸蛋白酶）。源自上皮的细胞还可以表达钙粘蛋白，其介导非常强的钙依赖性粘附或桥粒连接。在这种情况下，可能需要添加钙螯合剂（如 EDTA）来隔离钙，以有效地解离细胞。

优化解离后的活力

为了优化解离后的细胞活力，反应条件应与细胞接触的强度相匹配。例如，如果标准胰蛋白酶/EDTA 消化（通常为 0.05%-0.5%）不能有效消化细胞键（10-15 分钟内），则可能很难在细胞开始死亡之前将其从平板上移除，并且细胞活力也会受到影响。将会受到不利影响。在这种情况下，可能需要更高浓度的胰蛋白酶/EDTA 或其他酶，例如胶原酶。另一方面，如果反应过于剧烈，细胞可能会裂解或失去重新附着到平板上所需的表面蛋白，这两种情况都会导致活力降低。此外，裂解的细胞会释放基因组 DNA，导致活细胞聚集，使存活细胞更难重新铺板，因此需要添加 DNase。

准备是良好解离的关键

如果您已将反应强度与细胞系的粘附特性相匹配，但您的细胞仍然难以去除，您可能会发现问题在于细胞准备解离的方式。生长培养基中可能存在抑制胰蛋白酶的成分，例如血清，但这可以通过简单地用Dulbecco PBS冲洗细胞一到两次来克服 （不含钙或镁）在添加解离试剂之前。也可能是细胞保持汇合的时间太长。在这些条件下，细胞可能会形成异常牢固的细胞-细胞和细胞-表面连接，并且异常难以破坏。出于这个原因，以及为了培养物的整体健康，建议细胞在达到 100% 汇合（即 70-90% 汇合）之前进行传代。

结论

有了对解离试剂如何工作的基本了解，研究人员可以开发一种优化的方案，同时考虑细胞粘附特性的强度和质量。细胞解离的优化方案将确保成功传代并延长细胞在培养物中的寿命。