蛋白质印迹故障排除

故障排除

以下故障排除指南旨在解释蛋白质印迹中观察到的常见问题的原因和可能的解决方案。

Simple Western™ 可以克服传统蛋白质印迹法中需要排除故障的许多挑战，它可以在台式仪器内自动执行蛋白质印迹法的传统步骤。 Simple Western 使用毛细管电泳，消除了传统蛋白质印迹的凝胶到印迹转移，提供定量和可重复的结果。了解有关Bio-Techne 品牌 ProteinSimple 的Simple Western 仪器的更多信息。

无信号或信号弱

一抗浓度太低

• 增加一抗的浓度（滴定可能有帮助）。Novus 抗体浓度试剂盒可用于增加一抗浓度。

• 将孵育时间延长至 4°C 过夜

• 如果一抗重复使用次数过多，则有效抗体浓度可能太低；使用新鲜抗体来改善信号

目标蛋白浓度太低

• 每孔加载更多蛋白质（滴定可能有帮助）

• 使用已知表达目标蛋白的阳性对照裂解物、过表达裂解物或重组蛋白

• 确保裂解缓冲液是目标蛋白的最佳缓冲液；裂解缓冲液根据靶蛋白定位而有所不同。

• 如果需要增加非丰度蛋白质的浓度，请使用免疫沉淀或分级分离（即核分级分离）

• 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂

• 确保样品未降解

蛋白质从凝胶到膜的转移不成功

• 通过膜的丽春红染色或凝胶的考马斯染色确认蛋白质已成功转移到膜上。

• 通过分析加载控制表达式确认等量转移

一抗和二抗不兼容

• 确保二抗是针对产生一抗的物种而产生的

• （例如，如果一抗是在小鼠中产生的，则使用抗小鼠二抗）

膜选择不理想

• 检查抗原序列的疏水性/亲水性。 PVDF 膜可能更适合亲水性/极性/带电抗原，而硝酸纤维素膜可能更适合疏水性/非极性抗原

存在阻塞问题

• 封闭时间过长会掩盖某些表位并抑制抗体结合；减少封闭孵育时间或封闭液浓度

• 切换到不同的阻塞解决方案

膜冲洗过度

• 随着时间的推移，检测试剂可能会变得不活跃。确保试剂新鲜。二抗可以通过将其点在膜上并与检测试剂一起孵育印迹来进行测试。

• 处理低丰度蛋白质时，使用更灵敏的试剂（滴定可能有帮助；如果稀释，请使用高纯水）

图像曝光时间太短

• 增加曝光时间（多次检查以达到最佳曝光时间）

抗体仅识别天然蛋白质

• 如果使用仅识别天然蛋白质的抗体，请勿使用还原的变性蛋白质

目标是低分子量

• 减少传输时间以防止过度传输。对于小蛋白质以及孔径较小的膜（0.2 μm 与 0.45 μm），建议使用湿转法

发生叠氮hua钠污染

• 叠氮hua钠（通常用于储存一抗）会抑制 HRP 活性。确保充分洗涤以去除叠氮hua钠的存在或使用不含叠氮hua钠的缓冲液。

高均匀背景

阻挡不足

• 增加封闭时间和/或温度

• 增加封闭剂的浓度（尝试达到10%）

• 考虑更换封闭剂（牛奶与 BSA）

• 在抗体缓冲液中加入可选的封闭剂（也可以增加百分比）

阻止不兼容

• 对于磷酸化蛋白质的检测，不建议使用牛奶（牛奶和酪蛋白富含磷酸化蛋白质）

由于高抗体浓度导致非特异性结合

• 降低初级或次级的浓度（滴定可能有帮助）

• 在抗体缓冲液中加入封闭剂

• 通过执行二抗对照来确认二抗的特异性：省略一抗，仅将印迹与二抗一起孵育。

未结合的抗体洗涤不充分

• 增加洗涤次数和/或时间

干膜

• 确保在蛋白质印迹实验过程中膜永远不会变干

胶片曝光时间太长

• 降低曝光时间（可能需要测试一系列曝光时间）

检测试剂过于敏感

• 用纯水稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂

非特定条带/尺寸错误或多条带

目标蛋白丰度低于非特异性结合阈值

• 在 SDS-PAGE 凝胶中加载更多蛋白质

• 通过免疫沉淀或分级分离富集低丰度蛋白质

样品降解

• 使用新鲜裂解物

• 将样品放在冰上，直到样品缓冲液添加和沸腾之前

• 如果检测磷酸化靶标，则始终包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

可能存在其他蛋白质亚型

• 可能存在选择性剪接或多聚体形成。在这种情况下，可能需要异构体特异性抗体。

可能存在翻译后修饰

• 预测的分子量可能受到许多因素的影响，例如糖基化、磷酸化和蛋白质加工（从前体形式裂解为成熟形式）。为了确认特异性，进行阳性和阴性对照，例如重组蛋白或过表达裂解物、下调的敲低/敲除裂解物

有斑点或漩涡的背景

膜处理不当

• 尽量减少与膜的接触。使用干净的工具处理膜

缓冲液污染

• 制作新鲜的缓冲液

气泡

• 转移前滚平凝胶和膜之间的所有气泡

HRP聚合

• 使用 0.2 μm 过滤器过滤二抗以去除聚集物

洗涤不足

• 增加洗涤缓冲液的体积

• 增加洗涤次数和/或持续时间

其他事宜

白色/空心带

• ECL 底物消耗太快。降低一抗/二抗浓度或减少蛋白质用量

条带/泳道涂污（样品超载）

• 每个泳道中加载较少的蛋白质

分子量标记泳道为黑色

• 抗体可能与分子量标记发生反应

• 在分子量标记和第一个样品泳道之间添加空白泳道

膜蛋白详细介绍

膜蛋白是与细胞区室或细胞器的细胞膜相关或附着的蛋白质。它们代表了最大和最重要的蛋白质类别之一，可以分为外周或整体。

在过去的几十年里，已知的人类蛋白质编码基因的数量总是略有变化，但近年来，绝对数量围绕着20.000个基因（Piovesan，Antonaros和Vitale）旋转。 这些蛋白质中约有三分之一是分泌蛋白或膜结合蛋白，虽然这是整个蛋白质组的重要组成部分，但其中只有少数在结构上是已知的。由于所有获批的疗法中约有一半靶向膜蛋白，解析这些治疗相关膜蛋白的结构非常有利于未来的药物设计。

膜蛋白质组和分泌组被认为是最大和最重要的蛋白质类别之一。膜蛋白被定义为与细胞膜或细胞内细胞器相关或附着的蛋白质。它们分为外周蛋白和整体蛋白。外周膜蛋白是 时间上 与脂质双层相关，但不能全部跨越膜。通过外周区域的穿孔或与整合膜蛋白偶联来实现对脂质双层的附着（参见 图3，B&C).这些完整的蛋白质嵌入，跨越整个脂质双层，并包含位于膜内的疏水性α-螺旋或β-桶结构。根据它们的细胞功能，它们可以进一步细分为受体或通道等组。

与亲水性细胞外和细胞内结构域一起，大多数膜蛋白表现出两亲性特征。两亲性特征还产生了一种特征，通过该特征通常可以识别完整的膜蛋白。这是由于它们的一级结构在其线性序列中含有19-23个疏水氨基酸，需要跨越膜的疏水内部。带有指向桶外部的疏水残基的β桶也可以作为膜蛋白的良好指标。

在许多生理和病理过程中，试剂、转录因子、蛋白质或离子需要通过膜屏障。如果成功，它们会触发信号通路，发送生长和凝血因子或传递无法穿过脂质双层的蛋白质信号，如细胞因子。因此，膜蛋白位于许多细胞过程的一个非常重要的交叉点。

为此，膜蛋白接管了许多关键功能，例如蛋白质和离子通过特殊通道的运输或许多生物体内的信号转导。它们还负责细胞间连接或细胞间识别，使细胞之间的快速通信和外来细胞的有效识别，这对免疫系统至关重要。

分类 和 功能

目前，TCDB（转运体分类数据库）列出了92个超家族，其中有1600多个转运蛋白家族。由于数量庞大，我们只想在下面对这些传输器类进行一个小的概述：

1. ABC-转运车
   ATP结合盒转运蛋白超家族是最大的基因家族之一。在大多数情况下，它们由多个亚基组成，分为疏水跨膜结构域和亲水膜相关ATP酶。作为分子泵，它们利用ATP水解的能量在细胞膜上移动各种溶质（Jones和George，2002）。
   
   

2. 离子通道
   造孔蛋白促进离子流过细胞膜。根据类型进行细分，通过分类为门控机制，按离子类型或细胞定位进行细分。第一组中类型是电压门控离子通道，例如许多Na+， K+, 或 CA2+ 渠道。从生物学上讲，它们是神经系统的关键组成部分。同样，它们参与肌肉收缩或T细胞活化也同样重要。
   
   

3. 膜结合ATP酶
   顾名思义，ATP酶超家族利用ATP来执行其功能。它们分为 F、V 和 P 型 ATP 酶。F型和V型ATP酶被归类为旋转ATP酶，而P型ATP酶利用ATP水解释放的自由能驱动其构象变化（Palmgren和Nissen，2011;Pizzagalli， Bensimon， and Superti-Furga， 2020）。一种ATP酶是Na+/K+-交换剂，根据其浓度梯度泵送钠和钾，以维持细胞膜电位。
   
   

4. SLC-转运车
   溶质载体蛋白是转运蛋白的超家族，通过膜转移多种溶质。这些包括糖、氨基酸、维生素或金属等分子（Hediger 等。, 2013).因此，它们是进入或离开细胞的主要调节剂之一，许多生理和细胞过程都依赖于它们（Pizzagalli、Bensimon 和 Superti-Furga，2020 年）。
   
   

5. 水道
   水通道蛋白或水通道促进水流过膜。因此，它们在维持水平衡方面发挥着基本作用。

功能

1. 酶活性 – 各种代谢途径的代谢物和底物的加工

2. 信号转导 – 化学信使与膜蛋白结合位点相互作用以发出信号

3. 传输（主动/被动） – 在不同的细胞膜上移动分子和其他物质

4. 细胞间识别 – 细胞之间的识别，即与免疫系统相关的细胞

5. 细胞间连接 – 不同的结点，如间隙或紧密结连接相邻的电池

6. 锚固/附件 – 对细胞骨架网络、蛋白质位置和某些形状的维持很重要

组成、结构和 配置

类型 膜传输过程

简单扩散
例如，分子、离子或颗粒从较高浓度的区域沿其梯度向下移动到较低浓度的区域。运动一直持续到达到平衡。带电粒子可以向一个方向或另一个方向移动这种膜电位。

被动运输
较大分子（如糖或氨基酸）的简单扩散的类似物。膜转运蛋白使在正常条件下无法通过膜的底物沿着浓度梯度向下移动。

• 通道蛋白
  跨越细胞膜的特殊跨膜蛋白。门控机制可由配体、膜电位变化或机械过程（例如细胞骨架变化）触发。
  
  

• 载体蛋白
  对于这种类型的被动转运，分子通过特殊载体的构象变化进行转移。这种变化是由基板对接到载体触发的。运输方式可以用单个分子（Uniport）进行，两个分子沿同一方向（Symport）或相反方向（Antiport）移动。
  
  

主动运输
主动运输是一种需要外部能量才能执行其机制的运输形式。这使得分子或离子能够相对于其浓度梯度或电势梯度传输。能量的形式可以是化学性质的（ATP）或电荷。也可以利用浓度梯度作为能量来源。

• 主要主动传输
  质子和无机离子通过利用ATP的能量在细胞膜中移动。Na-K泵是这种传输形式的一个例子，它传递三个带正电荷的钠离子和两个同样带正电荷的钾离子。
  
  

• 二次主动传输
  类似于被动载体蛋白同源蛋白和反转运蛋白，这次其中一个离子随着其浓度梯度移动，而第二个离子则与其相反移动。这可以在同一方向（Symport）或相反方向（Antiport）上实现。因此，电化学梯度是这里的驱动力。
  
  

• 三级主动运输
  对于这种类型，三个转运体需要串联运行。第一转运蛋白建立分子的电化学梯度 一个 （主要活动）。第二转运蛋白利用分子 一个 为分子建立有利的电化学梯度 B （辅助活动）。最后，转运蛋白三利用分子梯度 B 移动分子 C 反对其浓度梯度（Hamm，Alpern和Preisig，2008）。
  
  

• 群体易位
  这是一种特殊的细菌运输形式。要运输的基材在此过程中会发生化学变化。因此，不会产生浓度梯度。作为一种能量形式，可以使用ATP，但还有其他能量来源，如PEP（磷酸转移酶系统），也用于葡萄糖运输过程（见 图12、组易位）。

相关历史

挑战 和 展望 用于医药/工业

同时，已经应用的实验方法，如 纳米盘系统，环烷烃改性 两栖动物或 阿斯蒂 共聚物也将进一步发展，推动我们的知识边界向前发展。

未来，人工智能和此类实验方法的交织将引入生物和医学研究的新时代，塑造数字生物学或生物医学计算等领域。新方法将更新我们的药物发现过程，极大地加速它们。无论我们追求什么路径，膜蛋白质组都将在其中发挥至关重要的作用。

炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质与染料叠氮化物或炔烃的缀合

蛋白质标记缓冲液适用于 CuAAC 与蛋白质的反应，可保护生物分子免受活性氧的损害。该反应可用于具有炔烃或叠氮基团的蛋白质，以及用叠氮基团代谢标记的细胞或细胞裂解物的组分。

叠氮化物与末端炔烃缀合，形成五元杂环（1,2,3-三唑）。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 化合物存在下进行，几乎不依赖于 pH 值。蛋白质标记缓冲液针对蛋白质操作进行了优化，含有铜 (II) 盐（催化活性铜 (I) 化合物的稳定前体）、醋酸三乙铵 pH 6.8、水溶性 THPTA 配体和氨基胍。建议使用新鲜配制的 抗坏血酸溶液减少铜(II)。蛋白质标记缓冲液中的 THPTA 配体通过稳定铜 (I) 的催化活性化合物来加速反应。 THPTA 配体的存在还允许在水介质（无有机溶剂）中进行蛋白质标记，并且由于铜 (I) 氧化程度的稳定，最大限度地减少活性氧 (RAS) 的产生，并防止它们通过氧化组氨酸、蛋氨酸来损坏蛋白质和半胱氨酸。蛋白质标记缓冲液中的氨基胍可防止化学反应性醛（脱氢抗坏血酸水解产物）与精氨酸、N 末端半胱氨酸和赖氨酸的侧链结合。

对于此反应，您将需要无叠氮钠缓冲液中的炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质、叠氮染料或 炔烃、1.5х蛋白质标记缓冲液和抗坏血酸。建议在惰性气体（氮气或氩气）下执行步骤 6 至 9。

协议

我们推荐以下方案用于修饰蛋白质与染料衍生物的缀合：

1. 根据要使用的修饰蛋白的量确定总反应体积：

   ！炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质溶液的体积不应超过总反应体积的1/3。

   总反应体积，μL	蛋白质含量
   100	4至20纳摩尔
   200	20至40纳摩尔
   400	40至80纳摩尔
   600	80 至 600 纳摩尔

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   染料叠氮化物或炔烃	（蛋白质含量 [nmol]）× 0.3*	10 mM DMSO 或水
   蛋白质标记缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂（抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水	（总反应体积 [μL] – 染料溶液体积 [μL] – 蛋白质标记缓冲液体积 [μL] – 活化剂溶液体积 [μL]）	—

   * 染料过量可能会根据蛋白质分子上叠氮化物或炔基的数量而变化。表中显示的计算结果为 3 倍过量的染料。对于 1.5–10 倍过量的染料，将蛋白质含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但请记住，如果您使用不溶于水的叠氮化物或炔烃，则过量时它可能会从反应混合物中沉淀出来。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

3. 准备 染料叠氮化物或炔烃（10 mM 溶于 DMSO 或水中，适用于水溶性炔烃和叠氮化物）和活化剂（抗坏血酸，50 mM 水溶液）的储备溶液。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液 （该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg 抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将蛋白质标记缓冲液添加到修饰的蛋白质溶液中并涡旋。

5. 添加计算体积的叠 氮化染料或炔烃储备溶液，并再次涡旋均匀。

6. （推荐）对混合物进行脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气或氮气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时进行多个标记反应，可以使用离心浓缩器进行脱气。为此，将管子放入浓缩器中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端输送惰性气体。

7. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

8. 涡旋溶液。

9. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

10. 使用透析或尺寸排阻色谱分离染料-蛋白质缀合物。