荧光计的工作原理

荧光计是用于精确定量微升 (μL) 样品中的各种生物分子（例如核酸和蛋白质）*工具。这些仪器在生命科学、环境监测、药品质量控制和生物工程应用等广泛的生化领域发挥着至关重要的作用。通过提供高灵敏度测量，荧光计能够对亚皮克浓度的样品进行定量。这篇博文将探讨荧光计的工作原理，阐明其基本机制并强调其在科学研究和分析中的重要性。

了解荧光计的功能

荧光计的工作原理是根据荧光对生物分析物进行定量。要开始该过程，需要将感兴趣的样品与特定的荧光剂结合，并使用聚丙烯管将其装入仪器中。有许多市售荧光试剂，包括核酸染料、细胞功能染料和荧光蛋白，使科学家能够根据自己的特定需求定制实验。 

荧光团具有吸收特定激发波长的光并随后以较低的能量发射或发出更长波长的光的能力。某些荧光团在与特定分析物（例如双链 DNA (dsDNA)）结合时会增强荧光。通过直接将检测的荧光强度 (RFU) 与样品中所需生物分子的数量相关联，科学家可以准确测量它们的浓度。

荧光测定的灵敏度

荧光测定法是一种极其灵敏的方法，能够以低至 0.0005 纳克/微升 (ng/μL) 的灵敏度检测生物分子。此外，荧光测定法可为所需分析物提供检测，有效消除因样品污染物或未知元素可能引起的测量误差。通过根据检测中已知生物分子的荧光强度对未知物的浓度进行数学量化，科学家可以可靠地确定目标分子的精确浓度水平。

传统荧光测定法的挑战

尽管传统荧光计具有众多优点，但仍然具有主要局限性：缺乏测定独立性。这些仪器通常是预先设计的，具有有限的激发和发射通道，从而限制了荧光测定的选择。然而，DeNovix 通过设计一种新型荧光计来应对这一挑战，改变了该领域。我们的荧光计配备了四个发射和激发通道，在选择荧光检测方法方面提供了灵活性。通过覆盖广泛的激发 (375 – 635 nm) 和发射 (435 –740 nm) 光谱，这些仪器支持一系列扩展的定量分析，适用于测量 dsDNA、ssDNA、RNA、蛋白质甚至定制的浓度水平化验。

DeNovix 荧光计简介

荧光计在科学研究和分析中发挥着至关重要的作用，能够在各个领域对生物分子进行精确定量。通过利用荧光原理，这些仪器提供高灵敏度测量，使科学家能够准确确定样品中核酸和蛋白质的浓度水平。  

传统荧光计的灵活性一直受到限制，但我们 DeNovix 通过提供具有扩展检测选项的仪器，开创了荧光测定的新时代。借助我们先进的荧光计，研究人员可以探索更广泛的定量分析，确保实验中特异性和灵敏度。

在 DeNovix，我们制造专为研究应用量身定制的创新测量设备。我们为成为荧光测量仪器的供应商之一而感到自豪，我们提供荧光计技术，保证荧光测量中灵活性、灵敏度和可重复性。

DS-11系列

我们的DS-11 系列仪器将高动态范围荧光测定设备与微量吸光度能力相结合，为微升样品中的生物分子提供非常好检测。它们结构紧凑、易于使用，并允许进行全光谱紫外-可见分析和荧光，是快速核酸和蛋白质定量的理想选择。

QFX荧光计

我们提供的另一个解决方案是QFX 荧光计，适用于灵敏、可重复的荧光测定应用。它是另一种易于使用的仪器，提供直观的触摸屏界面，可实现无差错运行且无需设置。QFX 用于核酸和蛋白质定量，可与定制荧光应用程序配合使用以实现荧光团分析。与同类其他荧光计相比，QFX 在灵敏度、重现性和数据质量方面表现出色。

LS染料简述

具有大斯托克斯位移的 ATTO 染料

ATTO-TEC提供两种新型荧光标记，斯托克斯位移高达165 nm。这些染料特别适用于多重处理领域，因为大的斯托克斯位移可最大限度地减少检测通道中的信号重叠。

两种染料都非常亲水，并且具有高荧光量子产率的特点。与许多其他荧光标记物相比，与生物分子（例如蛋白质）偶联后，荧光效率仅略有降低。即使具有高度标记（DOL）也是如此。
这些染料有 NHS 酯、马来酰亚胺、叠氮化物等变体，并且带有游离羧基。此外，还提供链霉亲和素和鬼笔环肽的缀合物。  

如何选择染料

为了使用荧光标记物获得最佳结果，必须考虑几个因素。

首先，这是激发光源：为了减少样品自发荧光可能产生的干扰，激发波长优选在550 nm甚至600 nm以上。除了减少背景之外，红色光谱范围在处理活细胞时也具有优势，因为可以减少损伤。

其次，荧光标记应在激发波长下具有强吸收以及高荧光量子产率。消光系数和荧光量子产率的乘积通常称为染料的“亮度”。

染料的荧光效率在光谱的蓝色和绿色区域最高。在某些情况下，量子产率几乎达到100%的理论极限。对于更长的波长，发射的量子产率急剧下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功开发出即使在 650 nm 下也具有高量子产率的荧光标记。例如，ATTO 647N在水溶液中发出的荧光强度是旧花青染料 Cy5 ™的两倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相对荧光强度。PBS 水溶液1 cm 池中相应吸收最大值处的吸光度为 0.04。22 °C 时两个吸收光谱（相同吸收）交叉处的荧光激发。

 
最后，标记物的发射光谱应与所用滤光片组的传输相匹配。反过来，必须选择滤光片组，使其阻挡样品散射的激发光并允许荧光尽可能有效地通过。

当使用波长为 635 nm 的二极管激光器作为激发源以及在 650 nm 至 750 nm 之间具有高透射率的滤光片组时，例如ATTO 647N将是一个非常好的选择。从ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm处具有高消光系数，接近吸收曲线最大值的波长，以及优异的荧光量子产率（η fl = 65%）。

下表概述了一些常用的激励源和推荐的ATTO标签。
 

荧光标记物的特性
然而，应该注意的是，除了已经讨论的光学考虑因素之外，选择标记时其他因素也很重要，例如染料的 pH 依赖性光学和化学特性、其溶解度、光和化学特性稳定性、发色团的大小或连接体的长度等，其涉及或满足各自应用的要求。这些特性与染料作为荧光标记物的适用性非常相关。

最重要的是，染料在照射过程中保持完整。许多常见的标记，例如荧光素衍生物 FITC，具有非常低的光稳定性。因此，当长时间观察过程时，使用高强度激光激发时成像的灵敏度和质量会受到限制。这对于显微镜和其他基于共焦原理的技术（例如单细胞的检测）来说是一个严重的缺点。与一些常用的旧染料相比，新型ATTO标签的设计即使在长时间暴露后也显着更加稳定。

ATTO 655与传统 Cy5的光稳定性比较TM在水里。使用 250 W 卤钨灯照射，聚焦到 1 cm 池中。消光与照射持续时间。

许多常见的荧光标记物即使在没有照射的情况下（即在黑暗中）也会分解，特别是当暴露于实验室大气中的低浓度臭氧时。在相同的臭氧暴露条件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的稳定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM长 100 倍。这在微阵列应用中非常重要，因为染料分子位于表面，因此直接暴露在大气中。

紧凑而强大的激光二极管现在覆盖了光谱的整个可见光和近红外部分。它们已作为非常有效的激发源进入许多应用/设备，并越来越多地取代传统光源。

如果没有最大吸收与现有激发源的波长完*对应的标记，则应选择波长稍长的染料。吸收会稍微降低，但激发波长和荧光光谱之间的较大差异（与激发波长无关）具有在检测过程中更好地分离散射激发光的优点。

什么是荧光猝灭？

化合物的荧光可以通过多种过程猝灭（即减少或完*消除），而不会破坏荧光团。荧光猝灭效应导致荧光强度降低。一旦猝灭剂被移除或猝灭机制被“关闭”，原始的荧光强度就会重新出现。

猝灭效应导致荧光分子的电子激发态在没有辐射的情况下返回基态，或者阻止实际激发到荧光态。

在实践中，荧光猝灭在许多应用中得到利用，因为它是一种易于观察或测量的现象。因此，它是分子水平上发生的过程的指标。例如，分析物的存在或不存在会导致荧光团和猝灭剂之间的距离发生变化，从而导致荧光发生变化。除了荧光强度之外，寿命有时也可以用来衡量这种变化。

分子信标
包括所谓的“genepin”、“hairpin”或“分子信标”技术。例如，在这些“智能探针”中，荧光染料和荧光猝灭剂位于单链 DNA 的相对两端。由于末端片段上有几个互补碱基，杂交发生在那里，即产生了部分 DNA 双链。DNA 的中间片段因此形成一个环：所得结构类似于发夹。标记物的荧光现在被猝灭剂的空间接近性猝灭，例如通过 FRET 机制。如果现在将与第一条链的碱基序列互补的DNA链添加到溶液中，则由于所有碱基更强的相互作用，这两条链会杂交。染料和猝灭剂在空间上分离，导致荧光重新出现。您可以利用这一原理设计许多不同类型的实验并得出有关分子过程的结论。
除了使用染料-猝灭剂对之外，还可以使用两种荧光染料，其荧光行为如福斯特共振能量转移中所述。