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特点：
● 固定后仍可检测
● 荧光滞留性强
● 灵敏度高
产品解说
产品概述
线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。
产品特点
解决传统试剂的三个问题
观察线粒体膜电位时，使用JC-1、TMRE、TMRM，但由于PFA不可固定、容易淬灭，数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。
并且，通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer，可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。
①固定后也可检测
由于微小的细胞状态的变化，也会造成线粒体膜电位发生变化，所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂（JC-1、TMRE）如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光，所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作，也能保持荧光，因此可以进行高重复性的实验。
②可监控
没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色，确认了荧光强度的变化。结果，JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降，MT-1仍保持了一定的荧光强度
③高灵敏度
线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况，在这种情况下，使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。
与各种试剂的比较
| Features | Sensitivity | Fixation | Monitoring | Fluorescence change (upon loss of mitochondrial membrane potential) | Detection (ex/em) |
|
| JC-1 (JC-1 MitoMP Detection Kit) |
Recomended for starting-up | ✓ | Color change from red to green | Green: 450-490 nm / 500-550 nm Red: 530-560 nm / 570-640 nm
|
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| MT-1 (MT-1 MitoMP Detection Kit) |
Recommended for more detailed analysis | ✓ (High) |
✓ | ✓ | Decrease in fluorescence intensity | 530-560 nm / 570-640 nm |
| TMRE | Widely used | ✓ (High) |
Decrease in fluorescence intensity | 530-560 nm / 570-640 nm |
实验例
1.通过去极化的实验例
通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞，用该试剂观察膜电位的变化。
结果，确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。
2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化
预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide，诱导凋亡后，与Annexin V、FITC Conjugate一同染色，并通过流式细胞仪检测。
结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化（绿色荧光强度的增加）确认了凋亡的发生，以及从MT-1产生的荧光强度变化（红色荧光强度的降低）发现了线粒体膜电位的变化。
3.同时评估线粒体超氧化物和膜电位
用 HBSS 冲洗 HeLa 细胞后，用 MT-1 线粒体氧化酶检测试剂盒和线粒体超氧化物检测染料（(mtSOX Deep Red： MT14）共同染色，同时观察线粒体 ROS 和膜电位的产生情况。因此，线粒体膜电位的降低和线粒体 ROS 的产生是同时观察到的。
＜成像条件＞（共聚焦显微镜）
MT-1: Ex=561, Em=560-600 nm
mtSOX: Ex=633 nm, Em=640-700 nm
Scale bar: 10 μm
＜检测条件＞（酶标仪）Tecan，Infinite M200 Pro
MT-1: Ex=540-550 nm, Em=590-610 nm (Gain=200)
mtSOX: Ex=545-555 nm, Em = 665-685 nm
常见问题Q&A
| Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么？ |
| A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。
细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解，请优化检测时间。 |
| Q2：MT-1检测后可以固定吗？ |
| A2：应使用4%多聚甲醛（PFA）固定，且不能与（Triton X-100、NP-40等）一起使用，因为这可能导致染泄漏。 |
| Q3：固定后可以对细胞染色吗？ |
| A3：由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位，因此固定后不适用于染色。 |
| Q4：是否需要做阳性对照？ |
| A4：作为阳性对照，可在技术手册中找到使用FCCP（羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙）的实验例。 |
|
Q5：优化染色条件时，应使用何种浓度的MT-1染料 |
|
A5：MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时，请参考以下内容。 <荧光强度弱> 请优化以下浓度：稀释500-1000倍。 <观察到非特异性吸附> 请优化以下浓度：稀释1000至2000倍。 |
| Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗？ |
| A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。 |
| Q7：添加MT-1工作液后，可以不清洗直接上机检测吗？ |
| A7：染色后，无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们，因为它们可能具有细胞毒性。
我们建议去除上清液并用培养基替换。 |
| Q8：MT-1染色后，是否可以用PBS代替HBSS来清洗？ |
| A8：我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS，我们建议使用培养基来代替清洗。 |
参考文献
| No. | Sample | Instrument | Reference |
|---|---|---|---|
| 1 | STHdh Cells | Microscope | N. Okada, T. Yako, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Hara, “Reduced mitochondrial complex II activity enhances cell death via intracellular reactive oxygen species in STHdhQ111 striatal neurons Q1 with mutant huntingtin”, J. Pharmacol. Sci., 2021, doi:10.1016/j.jphs.2021.09.001. |
| 2 | Panc-1 Cells | Microscope | N. Okuni, Y. Honma, T. Urano, K. Tamura, “Romidepsin and tamoxifen cooperatively induce senescence of pancreatic cancer cells through downregulation of FOXM1 expression and induction of reactive oxygen species/lipid peroxidation”, Mol. Biol. Rep., 2022, doi:10.1007/s11033-022-07192-9. |
| 3 | BM Cells | Microscope | Y. Aoyagi, Y. Hayashi, Y. Harada, K. Choi, N. Matsumura, D. Sadato, Y. Maemoto, A. Ito, S. Yanagi, D. Starczynowski, H. Harada, “Mitochondrial Fragmentation Triggers Ineffective Hematopoiesis in Myelodysplastic Syndromes”, Cancer Discovery, 2022, doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0032. |
| 4 | Flies indirect flight muscle Cells | Microscope | N. Nozawa, M. Noguchi, K. Shinno, M. Tajima, S. Aizawa, T. Saito, A. Asada, T. Ishii, M. Ishizuka, K. Iijima and K. Ando, “5-Aminolevulinic acid and sodium ferrous citrate ameliorate muscle aging and extend healthspan in Drosophila”, FEBS Open Bio, 2022, doi:10.1002/2211-5463.13338. |
| 5 | HBME Cells | Microscope | Y. Sakai, M. Taguchi, Y. Morikawa, H. Miyazono, K. Suenami, Y. Ochiai, E. Yanase, T. Takayama, A. Ikari, T. Matsunaga, “Apoptotic mechanism in human brain microvascular endothelial cells triggered by 40-iodo-α-pyrrolidinononanophenone: Contribution of decrease in antioxidant properties”, Toxicol. Lett., 2022, doi:10.1016/j.toxlet.2021.11.018. |
| 6 | MIN6-M9 Cells | Microscope | R. Inoe, T. Tsuno, Y. Togashi, T. Okuyama, A. Sato, K. Nishiyama, M. Kyohara, J. Li, S. Fukushima, T. Kin, D. Miyashita, Y. Shiba, Y. Atobe, H. Kiyonari, K. Bando, A. S. Shapiro, K. Funakoshi, R. N. Kulkarni, Y. Terauchi, and J. Shirakawa, “Uncoupling protein 2 and aldolase B impact insulin release by modulating mitochondrial function and Ca2+ release from the ER”, 2022, iScience, doi:10.1016/j.isci.2022.104603. |
| 7 | SH-SY5Y Cells | Flow Cytometer | M. Hashimoto, M. Fujimoto, K. Konno, M. L. Lee, Y. Yamada, K. Yamashita, C. Toda, M. Tomura, M. Watanabe, O. Inanami and H. Kitamura, “Ubiquitin-Specific Protease 2 in the Ventromedial Hypothalamus Modifies Blood Glucose Levels by Controlling Sympathetic Nervous Activation”, J. Neurosci., 2022, doi:10.1523/JNEUROSCI.2504-21.2022. |
| 8 | Fibroblasts, ciBAs | Microscope | Y. Takeda and P. Dai, “Chronic Fatty Acid Depletion Induces Uncoupling Protein 1 (UCP1) Expression to Coordinate Mitochondrial Inducible Proton Leak in a Human-Brown-Adipocyte Model”, 2022, doi:10.3390/cells11132038. |
| 9 | Sperm cells from C. osakensis queens | Microscope | A. Gotoh, M. Takeshima and K Mizutani, “Near-anoxia induces immobilization and sustains viability of sperm stored in ant queens”, Sci. Rep., 2023, doi:10.1038/s41598-023-29705-7. |
| 10 | Nucleus Pulposus Cells | Microscope | K. Suyama, D. Sakai, S. Hayashi, N. Qu, H. Terayama, D. Kiyoshima, K. Nagahori and M. Watanabe, “Bag-1 Protects Nucleus Pulposus Cells from Oxidative Stress by Interacting with HSP70”, Biomedicines, 2023, doi:10.3390/biomedicines11030863. |
| 11 | HL60 Cells, KG1a Cells | Flow Cytometer | K. Kamachi, H. Ureshino, T. Watanabe, N. Y. Sakai, Y. F. Kurahashi, K. Kawasoe, T. Hoshiko, Y. Yamamoto, Y. Kurahashi, and S. Kimura , “Combination of a New Oral Demethylating Agent, OR2100, and Venetoclax for Treatment of Acute Myeloid Leukemia”, Cancer Res Commun., 2023, doi:10.1158/2767-9764.CRC-22-0259. |
| 12 | RAW264 Cells | Microscope | H. Gu, Y. Zhu, J. Yang, R. Jiang, Y. Deng, A. Li, Y. Fang, Q. Wu, H. Tu, H. Chang, J. Wen and X. Jiang, “Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration”, Adv sci, 2023, doi:10.1002/advs.202302136. |
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