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特点：
● 可用荧光酶标仪高通量筛选
产品概述
胱氨酸(Cystine)是抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的来源，在细胞内的氧化还原平衡中发挥着重要的作用。在癌症研究领域，Sulfasalazine、Erastin等xCT(胱氨酸/谷氨酸反向转运体)抑制剂可以改变细胞内的氧化应激平衡，进而引发细胞死之一的铁死亡。而在免疫研究领域，据报道，巨噬细胞和中性粒细胞在免疫刺激剂的作用下，xCT的表达会增高并增加细胞内的GSH水平，以平衡自身出于攻击癌细胞目的所释放的ROS。因此，无论是对癌细胞的研究还是免疫细胞的研究都离不开胱氨酸摄取能力这一重要指标。
检测原理
试剂盒内含的胱氨酸类似物(Cystine Analog, CA)与胱氨酸一样可以通过xCT的转运进入细胞内。细胞裂解后通过添加Reducing Agent还原CA并与检测试剂FOdA特异性反应，生成可产生荧光的物质。[专利申请中]
检测实例
xCT抑制剂Sulfasalazine, Erastin的抑制效果评价
使用本试剂盒对xCT抑制剂Sulfasalazine和Erastin的抑制效果进行评价。荧光结果显示，两种抑制剂均对胱氨酸的摄取有明显的抑制作用。
与传统方法比较
以往在胱氨酸摄取检测时一般采用同位素示踪法，下面是本试剂盒与同位素示踪法结果的比较。
常见问题Q&A
| Q1：胱氨酸类似物(CA)具体是通过哪种转运体进入细胞内的？ |
| A1：Cystine Analog是通过胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)进入细胞内的。 |
| Q2：目前有检测实绩的细胞有哪些？ |
| A2：下列细胞都有检测实绩：人胶质母细胞瘤细胞, A172
人类肺泡基底上皮细胞, A549 人恶性黑色素瘤细胞, A375 人结肠癌细胞, HCT116 人肝癌细胞, HepG2 人早幼粒白血病, HL60 人纤维肉瘤细胞, HT1080 小鼠胚胎成纤维细胞, MEF 人小细胞肺癌细胞, SBC-5 人胶质瘤细胞, U-251 MG |
| Q3：胱氨酸类似物(CA)进入细胞后会被分解、代谢掉吗？ |
| A3：胱氨酸类似物(CA)的构造非常稳定，实验范围内的操作不会被分解或代谢。 |
| Q4：可以用这个试剂盒进行定量检测胱氨酸吗？ |
| A4：本试剂盒不是胱氨酸定量检测试剂盒。 |
| Q5：可以用这个试剂盒对进入细胞内的胱氨酸定量检测吗？ |
| A5：不能定量检测进入细胞内的胱氨酸，本试剂盒是针对细胞摄取胱氨酸能力的数值化检测试剂盒。 |
| Q6：样品间荧光几乎无差异时，应该如何确认改善？ |
| A6：请检查以下五点。
1. 细胞数量发生变化。 根据细胞数或蛋白质浓度校正测量值（荧光强度）。 更多信息，请参阅常见问题9 2.胱氨酸类似物尚未完全融入细胞。 请按以下目的对说明书中各操作时间进行调整 . 在无胱氨酸培养基中培养的时间（贴壁细胞操作 3，悬浮细胞操作 4）：5 – 30 分钟。 . 胱氨酸类似物吸收时间（贴壁细胞操作 4，悬浮细胞操作 5）：30 – 60 分钟。 3.未被细胞吸收的胱氨酸类似物残留在孔中，导致本底升高。 用 PBS 重复清洗（贴壁细胞：操作 5，悬浮细胞：操作 6）。 4.工作溶液降解，背景升高。 配置工作液一段时间后，工作液中的荧光染料可能会被降解，荧光强度可能会增加。 配置工作液后不要等待太长时间。 5.细胞类型的影响 不同类型的细胞对胱氨酸的吸收能力大不相同，吸收能力低的细胞本底可能相对较高。 下图显示了不同癌细胞对胱氨酸吸收能力的差异。 如果无法通过上述措施解决本底问题，我们建议您首先考虑常见问题中列出的经过验证的细胞类型。
|
| Q7：配制CA Uptake solution时，除了不含胱氨酸的无血清培养基以外，还可以使用哪些Buffer？ |
| A7：检测HeLa细胞时，有过使用HBSS或含有0.1% Glucose PBS（+）进行配制的成功实例。 |
| Q8：如何根据细胞数量或蛋白质浓度对测量值（荧光强度）进行校正？ |
| A8：我司推荐使用下表所列的方法。 由于校正方法和时间因使用的细胞（贴壁细胞和悬浮细胞）会有所不同，请参考下表校正【使用 UP05 测量的值】。 |
| 细胞 | 贴壁细胞 | 悬浮细胞 |
| 校正方法 | 核染色(荧光法) | 蛋白质定量: BCA法 (比色法) |
| 产品 | Cell Count Normalization Kit
【Code:C544】 |
Sodium bicinchoninate【Code:B037】 |
| 校正进行时间 | 操作说明书在对贴壁细胞进行实验步骤操作10(测量UP05)后使用该溶液 | 操作说明书在对悬浮细胞进行实验步骤操作9使用剩余的液体进行检测 |
| 校正操作步骤 | 参考Cell count Normalization KitCode:C544]的说明书中[更换培养基方法] | 请参考UP05操作说明书中的以下实验例。(XCT 抑制剂Erastin 对胱氨酸转运体活性的抑制(悬浮细胞:HL60) |
用【UP05 测量值】与【校正方法测量值】计算修正后的荧光强度。
校正荧光强度 = 【UP05 测量值】/【校正方法测量值】。
*【UP05 测量值】 = （样品孔测量值）- （空白孔测量值）
*【校正法测量值】=（样品孔测量值）-（无细胞孔测量值）
| Q9：一般使用哪种孔板比较好？ |
| A9：
下列厂家得孔板有过检测实绩：
公司名/ 产品名/ 货号 Ibidi/ μPlate 96 well ibiTreat black S 15/ Ib89626 AGC techno glass/ EZVIEW Glass Bottom Culture Plate LB 96well/ 5866-096 Thermo Fisher/ 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10/ 165305 |
| Q10：Cystine uptake solution可以长期保存吗？ |
| A10：CA Uptake solution无法长期保存，请提前计算好用量，务必现用现配。 |
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相关文献
1、K. Hayashima, H. Katoh, “Expression of gamma-glutamyltransferase 1 in glioblastoma cells confers resistance to cystine deprivation-induced ferroptosis”, J. Biol. Chem., 2022, doi:10.1016/j.jbc.2022.101703.
2、H. Chen, L. Cao, K. Han, H. Zhang, J. Cui, X. Ma, S. Zhao, C. Zhao, S. Yin, L. Fan, H. Hu, “Patulin disrupts SLC7A11-cystine-cysteine-GSH antioxidant system and promotes renal cell ferroptosis both in vitro and in vivo”, 2022, Food Chem. Toxicol., doi: 10.1016/j.fct.2022.113255.
3、X. Hu, Y. He, Z. Han, W. Liu, D. Liu, X. Zhang, L. Chen, L. Qi, L. Chen, Y. Luo, Q. Li, P. Chen, Q. Wu, X. Zhu and H. Guo, “PNO1 inhibits autophagy-mediated ferroptosis by GSH metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma “, 2022, Cell Death Dis., doi:10.1038/s41419-022-05448-7.
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