如何进行ELISA的优化？

检测的每个组成部分包括一抗和二抗、封闭剂、缓冲液、酶缀合物和底物，可以对其进行优化，以提高新开发的ELISA工作方案的性能。测试了不同浓度和时间的包被、封闭、样品培养和检测步骤，以找到检测的最佳条件。通常，一次测试一种成分，然而在某些情况下，可以通过应用棋盘滴定网格方法同时优化两种成分，如下所示:

图2:棋盘滴定网格法同时优化两种ELISA成分。本例显示了组件A与组件B的对比，所有其他组件保持不变。

优化涂层过程

可以在包被缓冲液中制备不同浓度的包被剂（靶抗原或捕获抗体），并且可以应用等体积的每种浓度来执行ELISA方案，以发现强信号对低背景的趋势。在某些情况下，根据涂布剂的性质，可能还需要优化涂布缓冲液和平板涂布时间的选择。

优化阻塞过程

可以使用ELISA方案测试相同体积的不同制备的或市售的封闭溶液，以确保非特异性结合最少，而不会影响检测信号强度。如果封闭溶液是内部制备的，可以调节不同浓度的封闭剂。

优化样品浓度

用于样品制备以生成校准曲线的标准稀释剂应尽可能模拟天然样品基质并测试不同的成分。用ELISA方案测试相同体积的连续稀释样品浓度。可以确定样品的标准曲线浓度和稀释线性的良好动态范围。样品稀释剂可能需要根据动态范围的光谱进行调整。

优化检测过程

在标准稀释液中制备的不同浓度的检测抗体可以用ELISA方案进行等体积测试，以找到适合强信号和低背景噪声的浓度。

辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶是ELISA中常用的两种报告酶。在标准稀释剂中制备的不同浓度的酶缀合物或酶缀合的二抗通过测试板中每种浓度的等体积并进行ELISA方案进行优化。可以确定产生具有最小背景噪声的强信号的浓度。底物需要对在动态范围内清晰检测的靶抗原敏感，并且能够用合适的仪器检测。

下表列出了包被和检测抗体及酶偶联物的推荐浓度范围，可用于确定比色ELISA优化的最合适实验条件。对于酶缀合物，查看制造商的说明书以了解更具体的浓度范围。可以使用未纯化的抗体，但可能需要比纯化抗体更高的浓度，并可能导致更高的背景噪声。建议使用亲和纯化的抗体以获得最佳信噪比。建议的浓度范围仅供参考；每个组件的单独优化将提供更好的结果。

表2:包被和检测抗体和酶缀合物的推荐浓度范围