细胞膜起着分隔细胞内和细胞外的作用，并且与细胞的移动和生长、神经信号的传达等细胞功能密切相关。因此，细胞膜的异常与各种细胞状态异常所造成的疾病（如离子通道病Channelopathy）有很密切的关联，被认为是非常重要的生物标记物之一。

由于操作简便并且可用于活细胞染色，小分子荧光探针是最常用的细胞膜染色方法。但是小分子荧光探针普遍存在细胞内停留时间短、水溶性差的问题。而PlasMem Bright是一种克服了现有小分子荧光探针问题的产品。 用PlasMem Bright观察细胞膜时，可以在染色后的1天以上进行长时间的荧光观察。

PlasMem Bright系列产品克服了现有市面上的细胞膜染色试剂的诸多缺点（细胞毒性高、停留时间短、不同实验系的兼容性差）。并且分别有Green/ Red两种产品，方便多重染色时自由选择。

*通过细胞核染色试剂染色后，神经细胞的形态变化(凝集)的比较得出的结论

使用各种细胞膜染色试剂进行染色HeLa细胞，经过24 h培养后对各染色试剂的荧光图像进行比较。结果发现，与其他公司的细胞膜染色试剂相比，PlasMem Bright系列产品的染色时间更长，膜上的停留时间也更长。

实验例：ES细胞群内部的细胞膜染色

将小鼠ES细胞在涂有明胶的玻璃底皿中培养4天，并将获得的细胞群，用PlasMem Bright Green（200倍稀释）染色15分钟，并使用共聚焦显微镜（Zeiss：LSM710）中观察。

结果，细胞群内部的细胞膜也可以用PlasMem Bright Green可视化观察。

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm.

*此实验例由庆应义塾大学医学院的石津 大嗣老师提供。

实验例：轴突神经细胞形态和线粒体定位的观察

由神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分化诱导的神经细胞，分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 进行染色。可以鲜明的观察到细胞的形状以及轴突内的线粒体。

（比例尺：200 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）诱导神经芽细胞（SH-SY5Y）为神经细胞。

（2）去除上清液，添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养30分钟。

（4）去除上清液，添加HBSS。

（5）使用荧光显微镜观察。

实验例：神经芽细胞（SH-SY5Y）中的线粒体检测

分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行染色，用共聚焦显微镜获得3D图像。可以鲜明的观察到细胞形态以及线粒体和细胞核的情况。

（比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）使用HBSS清洗SH-SY5Y细胞。

（2）添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞2次

（5）使用荧光显微镜观察。

  实验例：脑源性小鼠神经母细胞瘤的延时成像

使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green，染色N1E-115细胞30分钟并进行延时成像时，可以清楚地观察到神经细胞内树突和突起中的变化。

<培养条件>

・细胞：N1E-115细胞（脑源性小鼠神经母细胞瘤）

・培养基：5％FBS，1％含谷氨酰胺的D-MEM（低葡萄糖）

・培养设备：35 mm 玻璃底皿

<拍摄条件>

・成像设备：带培养箱的荧光显微镜

・拍摄时间：1小时，拍摄间隔：2分钟

*此实验例由芝浦理工大学系统科学与工程学院的涌澤 充 様、福井 浩二教授提供。

 实验例：与外泌体共染色

向PlasMem Bright Green染色的HeLa细胞中加入外泌体膜荧光染色试剂盒(ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red)染色的外泌体。可以观察到，由活细胞的细胞膜产生的内体(Endosome)中的外泌体，以及没有摄入外泌体的内体。另外，即使在固定染色的细胞之后，也可以像活细胞一样使存在于细胞膜来源的囊泡（内体）中的外泌体可视化。

(比例尺：5 μm）

(比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜 (PlasMem Bright Green, 绿)  Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm。

外泌体 (ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red, 红)  Ex. 561 nm / Em. 560-620 nm。

<实验步骤>

（1）接种Hela细胞，24小时培养。

（2）去除上清液，添加使用培养基稀释的PlasMem Bright Green（100倍稀释）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞3次。

（5）添加175 μlMEM培养基与ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red染色过的Exosome溶液25 μl。

（6）在CO₂培养箱中过夜培养。

（固定情况下）细胞使用HBSS清洗2次后添加4%PFA，培养15分钟后，使用HBSS清洗细胞2次。

（7）使用共聚焦显微镜观察

 实验例：烟草BY2细胞的膜染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色烟草BY2细胞5分钟，清洗后每5分钟拍摄一次并进行长时间观察。实验中可以清晰的观察到BY2细胞膜的荧光以及细胞分裂所形成的细胞板。

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

・转盘式共聚焦显微镜观察

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

・图中的时间按照00:00 (小时:分钟)表示

 实验例：拟南芥根的染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色拟南芥根15分钟，采用Z轴景深连续拍照的方法进行荧光观察，可以清晰的观察到立体的细胞膜分布情况。

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

・转盘式共聚焦显微镜观察，Z轴摄影

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

关联产品

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒

活死细胞双染试剂盒

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM

3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂

2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride

PlasMem Bright Green细胞膜染色试剂

细胞膜染色试剂—绿色

Cellstain- CFSE试剂

5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate

实验工具|稀释计算器|摩尔浓度计算器

近年来，以细胞表面抗原为目标的癌症治疗和诊断的相关研究引起了科研人员的广泛关注。目前较为常用的方法是利用荧光标记的抗体来检测细胞表面抗原(免疫荧光法)，但是由于许多细胞表面蛋白的表达水平不高，往往造成检测结果灵敏度低、适用范围小的问题。针对这些问题，同仁化学研究所专门开发了一种高灵敏度的荧光染色方法，即CLAMP法(quinone methide-based catalyzed signal amplification)。

*本产品是在日本九州大学片山佳树教授的指导下研制而成。

通过利用一抗、β-Galactosidase(β-Gal)标记的二抗、β-Gal的荧光底物CLAMP F405进行荧光染色。CLAMP F405自身没有荧光也无法通过细胞膜，在与β-Gal反应后会形成具有细胞膜透过能力的Quinone methide，在进入细胞后可以与细胞内氨基和巯基结合并发出荧光。因为该荧光强度经过β-Gal的酶反应而得到增强，因此可以高灵敏的检测细胞膜上蛋白质。

参考文献：Noguchi, K. et al., “β-Galactosidase-Catalyzed Fluorescent Reporter Labeling of Living Cells for Sensitive Detection of Cell Surface Antigens”, Bioconjugate Chem., 2020, 31(7), 1740–1744.

CLAMP法的操作步骤与一般的二抗法相同。依次加入目的蛋白对应的一抗、β-gal标记的二抗、染色液，简单的三步操作后即可开始检测。

PD-1L1性能比较表

同时准备PD-L1诱导表达的HepG2细胞以及作为对照组的CFSE染色的细胞。将这两个细胞样品混合后，用CLAMP检测PD-L1表达的细胞。从结果可以看出，在CFSE染色细胞中，没有任何CLAMP法阳性细胞出现，PD-L1表达的细胞被清楚地标记区分出来。说明CLAMP可以用于检测一般的二次抗体法很难检测出来的PD-L1表达的HepG2细胞。

*CFSE: 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3‘,6’-diacetate。(同仁货号：C375)

<检测结果>

<检测条件>

Blue:    Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm

Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm

FFPE组织切片-人小肠组织

分别用CLAMP法和酪酰胺信号放大法(TSA, Tyramide signal amplification)检测人小肠FFPE组织切片上的α 平滑肌肌动蛋白(αSMA, α-smooth muscle actin)和角蛋白。结果显示CLAMP法的灵敏度更高，并且清晰的呈现了组织的免疫荧光共染色。

*数据提供：日本京都大学医学部附属医院病理诊断科 平田胜启老师

① Protocol 1 (实验例：荧光显微镜检测HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 1，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

1. 将HeLa细胞(1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS) 培养基清洗2次。

3. 去除上清，加入100 µl μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, abcam) /MEM (10% FBS) ，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。

4. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS)培养基清洗2次。

5. 加入100 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体（ab136774, abcam）/MEM (10% FBS)，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。

6. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞2次。

7. 加入100 µl Staining Solution，37℃，5% CO2培养箱内培养30 min。

8. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞3次。

9. 用荧光显微镜观察荧光。（DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm）

② Protocol 2 (实验例：流式细胞仪检测HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 2，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

1. 在1.5 ml微管中用MEM培养基(10% FBS) 制成2 x 105 cells/tube HeLa细胞的细胞悬液。

2. 300×g离心5 min，去除上清。

3. 添加500 µl 2 μg/ml CD44抗体(ab189524, abcam)/MEM培养基(10% FBS)，吹打混匀。

4. 在37℃静置1 h。

5. 按下列步骤进行清洗。

Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl培养基吹打制成细胞悬液。

Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。

6. 加入500 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体(ab16774, abcam) /MEM培养基(10% FBS)，吹打制成细胞悬液。

荧光二抗法使用Alexa Fluor405标记的抗体 (ab175652, abcam)

7. 在37℃静置1 h。

8. 用HBSS替代培养基，重复步骤5的清洗操作，

9. 加入500 µl用HBSS配制的Staining Solution(悬浮细胞用)，吹打制成细胞悬液。

10.在37℃下，用微管旋转器(Tube Rotator)搅拌30 min。注意：不搅拌的话会造成灵敏度降低。

11. 300×g离心5 min，去除上清。

12.加入500 µl HBSS吹打混匀。

13.上流式细胞仪检测(LSR Fortessa X-20, BD)。 *BV421 filter set (Ex:405 nm, Em:430-470 nm)

③ Protocol 3 (实验例：检测固定化HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 3，用CLAMP法检测固定化HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

PFA固定细胞的准备

1. 将HeLa细胞 (1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除上清，用100 µl PBS清洗2次。

3. 加入100 µl 4% PFA/PBS溶液，室温静置30 min。

4. 去除上清，加入100 µl 0.1% Triton X-100/PBS溶液，室温静置30 min。

5. 去除上清，每孔加入100 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，室温静置30 min。

染色步骤

1. 去除上清，加入100 2 μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, Abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。

2. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。

3. 加入100 µl x500 β-Galactosidase 标记的抗体 (ab16774, abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。

4. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。

5. 加入100 µl Staining Solution，37℃静置30 min 。

6. 去除上清，用100 µl PBS清洗细胞3次。

7. 用荧光显微镜观察荧光。(DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm)

④ Protocol 4 (实验例：检测固定化MOLT4细胞的表面抗原PD1)

参照操作说明书的Protocol 4，用CLAMP法检测固定化MOLT4细胞上的表面抗原PD1。

<检测条件>

PFA细胞固定的准备

1. 在1.5 ml微管中加入(2 x 105 cells/tube)MOLT4细胞制成细胞悬液。

2. 300×g离心5 min，去除上清。

3. 添加500 µl 4% PFA/PBS溶液，吹打混匀。

4. 室温静置30 min，300×g离心5 min。

5. 去除上清，加入500 µl 0.1% TritonX-100/PBS溶液，吹打混匀。

6. 室温静置30 min，300×g离心5 min。

7. 去除上清，加入500 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，吹打混匀。

8. 去除上清后用100 µl HBSS清洗3次。

9. 室温静置30 min，300×g离心5 min，去除上清后开始染色步骤。

染色步骤

1. 加入500 µl 1 μg/ml PD1抗体(ab52587, abcam)/Blocking Buffer，吹打混匀。(同型对照使用IgG1KAPPA, 401408, Biolegend)

2. 室温静置1 h。

3. 按下列步骤进行清洗。

Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl Blocking Buffer吹打制成细胞悬液。

Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。

4. 加入<span style=”font-size: 11px; font-family: Arial; color: blac