cytion细胞培养解离技术概述

细胞培养物解离是细胞培养物维持的关键步骤。它涉及将细胞从其生长表面分离以进行传代培养或收获。本节概述了两种主要方法：使用无酶解离缓冲液和使用酶试剂。

1. 使用无酶细胞解离缓冲液

该方法非常温和，无需使用酶即可保持细胞完整性：

1. 准备

• 确保所有试剂在使用前加热至 37°C，以避免对细胞造成冲击。

2. 去除生长培养基：

• 从培养容器中丢弃旧的生长培养基。

3. 漂洗

• 每个 T75 烧瓶或 100 mm 培养皿用 5 ml 不含钙和镁的 PBS 冲洗细胞单层。

• 在室温下轻轻摇动容器 30 至 60 秒。

• 吸出并丢弃冲洗溶液。

• 再次重复此冲洗步骤。

4. 解离

• 将大约 5 ml 无酶细胞解离缓冲液添加到容器中。

• 在室温下轻轻摇动 1 至 2 分钟，然后在显微镜下检查解离情况。

• 如有必要，用手轻敲烧瓶或培养皿以去除细胞。

• 如果细胞贴壁，让它们在室温下再静置 2 至 5 分钟，并根据需要再次敲击，使用更多的解离缓冲液。

• 细胞分离后，添加至少 5 ml 全生长培养基以中和解离缓冲液并重悬细胞。

5. 活力检查

• 在传代培养过程中监测细胞活力，确保其保持在 90% 以上。

2. 使用其他试剂进行解离

该方法允许使用各种解离试剂：

1. 去除用过的介质

• 丢弃培养容器中的旧介质。

2. 洗涤细胞

• 用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞，或使用 EDTA。

• 将洗涤液轻轻添加到细胞对面，并摇动容器 1 至 2 分钟，然后丢弃洗涤液。

3. 解离

• 每 25 平方厘米的生长表面涂抹 2 至 3 毫升所选的解离溶液，确保覆盖细胞片层。

• 将容器在 37°C 下孵育并轻轻摇动。解离通常发生在 5 至 15 分钟内，具体取决于细胞系。

• 对于顽固的细胞，敲击容器可以加快这一过程。

• 仔细观察细胞以防止过度暴露和潜在的损坏。

4. 收获细胞

• 一旦细胞分离，将其直立，让它们收集在容器底部。

• 添加完整的培养基，然后通过移液到细胞层上分散并收集细胞。

• 计数并继续传代。

在这两种方法中，重要的是通过经验观察确定每个细胞系的最佳条件。该过程应保留细胞活力，在传代培养过程中应定期检查细胞活力是否超过 90%。这些程序为研究人员根据其细胞系的具体要求和特征进行调整奠定了基础。

关于细胞培养补剂

细胞培养补剂支持实验室定制和扩大培养基制剂以适应特定细胞培养应用，如蛋白质生产、杂交瘤生产、CHO（中华仓鼠卵巢）细胞应用及其他无血清工作流程等。在此整理的经细胞培养和昆虫细胞培养检验的补剂已细胞培养系统适用性检验。这一检验可让实验室在细胞培养应用之前无需筛选这类补剂。 

ITS补剂

无血清及低血清细胞培养基制剂通常需要补充血清中正常存在、健康培养生长必需的的因子。如需希望在培养基中减少或弃用胎牛血清（FBS）、要求培养基必须无动物来源成分或需要针对特定细胞培养应用调整营养成分及其浓度时，ITS试剂可用作基础补剂。ITS得名于其组成型营养成分，即胰岛素（insulin）、转铁蛋白（transferrin）和硒（selenium）。这种营养成分混合物的变体形式包括SITE

ITS及其变体中主要组成成分的生物学功能如下：

• 胰岛素是一种多肽激素，可促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸

• 转铁蛋白是铁转运蛋白。铁是一种必需微量元素，但其游离形式可能有毒。为了补充培养细胞所需成分，铁离子可与转铁蛋白结合后提供。

• 硒是一种正常存在于血清中的必需微量元素。

• 乙醇胺是一种可显著促进杂交瘤细胞增殖的脂肪酸。这一成分常添加到补剂中，用以优化培养杂交瘤的培养基。

• 丙酮酸钠可为某些特定的培养系统提供额外的碳源。

杂交瘤试剂

传统单克隆抗体制备方法需要使用补充动物来源血清的培养基。利用这类抗体进行研究或体外诊断应用时，血清的存在并不会引起严重的法规问题，而相关无血清培养基的开发工作主要集中在如何降低成本方面。随着抗体越来越多地被用作生物治疗剂，亟需不使用血清和其他动物产品即可确保稳健培养杂交瘤的培养基和试剂。

我们的Hybri-Max™补剂经培养检验，可最大限度提高杂交瘤培养性能。它们可与其他杂交瘤补剂配合使用，支持单克隆抗体实验室稳健培养。

氨基酸、抗生素和其他细胞培养补剂

我们的氨基酸补剂经细胞培养检验，既包含多胺试剂，也包含支持定制化富集细胞培养基制剂的单个氨基酸。我们完整的培养补剂解决方案包括胆固醇、乳铁蛋白、亚油酸、胰高血糖素、环糊精、酵母提取物、抗氧化剂、维生素、抗生素等。

定制GMP细胞培养产品介绍

液体产品

• 我们的工艺技术采用经认证的混合容器，可在通过0.2 μm系统或可选的0.1 μm系统进行无菌过滤前实现溶解。

• 最终的容器选择包括标准的PET瓶（100 mL–2,000 mL），以及带有便捷式连接器选项的标准或定制袋（1 L–500 L）。

• 用于运输的容器包括防拆封口，可确保安全。

• 葡萄糖溶液还具有HTST巴氏灭菌选项。

干粉产品

• 我们的工艺技术以针磨和锥形或筒形混合仪混合为特色，确保成品的均质性。

• 包装容器规格从小规模的瓶子到大规模的桶均可提供。

• 产品密封并配置防拆封口，可确保安全运输。

• EZBioPac 大包装粉末转移袋和准确称重技术是即用型交付的理想解决方案，无需进行任何称重操作。

• 压缩细胞培养基，如定制的EZMix™产品线，可提供与干粉培养基相当的性能，并为强化的上游工艺提供重要优势。压缩培养基易于水合重悬，需要较少的包装体积，并具有更好的流动性，从而可以显著节省成本，减少占地面积并增加上游灵活性。

干燥小规模的瓶子到大规模的桶。

• Prodr袋和准确称重技术是即用型交付的理想解决方案，无需进行任何称重操作。

Pre-GMP细胞培养基产品

• 此外，我们的imMEDIAte ADVANTAGE®服务可满足开发工作对小规模定制培养基、补料、补充剂和缓冲液的快速周转需求，其中液体产品的批次规格为1-200 L，干粉产品为0.5-20 kg。

我们的产品是在专用的设施中生产的，可满足无动物成分（ACF）或含动物成分（ACC）配方的行业要求。所有设施和设备的设计和操作均符合生物制药标准，并定期获得客户批准和审计机构确认。

我们的全球质量管理体系已通过ISO 9001:2015认证，且所有工厂均主动遵守赋形剂良好生产规范（GMP）联合IPEC-PQG指南以及欧盟药品良好生产规范指南附件1的适用章节。

原材料的选择和规格

当您需要原材料选择方面的帮助时，我们可在每一步都针对您的关键需求提供专家级的指导。我们拥有处理数百种不同类型原材料和原材料特性的经验。我们的原材料项目包括：

• 供应商管理 – 定义并协调正确的供应链以确保供应安全，并同时确保正确的原材料质量属性。我们要求供应商向我们提供变更通知、完整的场地和物料调查表，进行现场审计并根据需要提供有关其工艺的信息和其他来源信息。

• 原材料要求 – 我们的专家会对每种原材料的规格进行定义，包括内毒素、生物负荷、同一性、杂质、性能以及必要时其他原材料特定属性的生物工艺特异性需求。

质量检测和文档

正确的质量测试和文档记录是定制细胞培养产品的基本特征。例如，我们可提供：

• 标准检测 – pH、重量克分子渗透压浓度、外观、溶解度、生物负荷（干粉）或无菌性（液体）

• 可选检测 – 支原体测试、细胞性能测试、氨基酸和维生素等分析型分析

  • 我们还深知痕量元素的重要性及其对蛋白质和产品质量的影响，因此我们可将痕量元素测试添加到您的产品规格中。

• 除了药品物质备案所需的支持文档外，每个订单还包括安全数据表和一份分析证书。