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Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

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Cygnus Technologies 近日宣布将MockV  Solutions公司旗下产品线整合至CygnusTechnologies品牌中。Mock VSolutions是一家研发生物工艺中病毒清除情况检测产品的公司。MockV Solutions的加入使Cygnus Technologies产品线进一步扩大，并进一步确立其在全球生物工艺污染物检测的领先地位。

在治疗药物产品的生产中，例如抗体药物、疫苗产品、血液制品等，病毒污染是一项固有的风险，它不仅可以导致工厂停工，更严重的情况下，可以影响药品安全及病人身体健康。中国NMPA、美国FDA、欧洲CPMP/BWP以及ICH等全球的药品监管机构都需要制药企业对产品中病毒清除/灭活的情况进行验证。并且，各机构对产品研发的不同阶段所需要验证的项目和标准也有所不同。例如，IND阶段，需要对以逆转录病毒、细小病毒和疱疹病毒的清除能力做出验证。病毒清除情况的验证通常需要通过活病毒实验来完成。但是由于开展活病毒实验需要对实验场所、设备、人员等有着一系列特殊的要求，这给这项验证工作和生物技术企业带来了很多挑战。而且如果验证失败，将在金钱和时间上造成过大的损失。

MockV Solutions开发了一种基于Mock Virus Particles（MVPs）的技术用于工艺中病毒清除情况的确认。MVPs的形态、理化性质以及功能都类似于病毒，但不具有传染性。因此可将MVPs作为活病毒的替代品加入并应用到纯化过程中，再对纯化后得到的溶液进行Immuno-qPCR检测确定病毒清除情况。

现阶段MockV Solutions已经推出MVM-MVP试剂盒（货号M-219），即模拟小鼠细小病毒（MVM）的MVP试剂用于病毒清除研究(MVM是一种模式细小病毒并常用作生物制药工艺验证的国际监管标准)。同时，MockV Solutions还在研发用于模拟逆转录病毒的清除验证相关产品（RVLP），预计于2021年上市。

现阶段由于这项技术刚刚应用不久，MVM-MVP等试剂盒还不能完全替代产品最终申报时采用活病毒所做的验证。但这些试剂盒可以在真正开展活病毒验证前，以一种经济实用的方式积累数据提供理论基础。当有了多年研发工艺中积累的这些有效和稳定的数据时再开展活病毒验证会避免验证的失败，从而减少潜在的时间和金钱损失。同时，MockV团队已经与FDA共同开展了一些研究（如Characterization of Non-Infectious Virus Like Particle Surrogates for Viral Clearance Application. Johnson et al. 2017）来比较MVM-MVP与活病毒验证的差异，并正在推动MVP技术至少可以替代IND阶段的活病毒验证数据的工作。所以，从工艺初期就采用MVM-MVP试剂盒对病毒清除情况进行验证，不仅可以在长期的研发阶段中积累重要的数据，更有可能在未来产品申报时减少验证工作量和时间。

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

MVM-MPV试剂盒Immuno-qPCR检测原理

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

作为Cygnus中国一级代理商，上海金畔生物科技有限公司多年来向中国客户提供了高品质的HCP、DNA、ProteinA等污染残留检测产品，以及AAE覆盖率验证，专属抗体和试剂盒开发等服务项目。上海金畔生物科技有限公司对Mock VSolutions能够加入到Cygnus Technologies品牌表示衷心的祝福，希望今后能为中国客户提供更多更好的产品和服务。为了能让更多的中国客户了解MockV的技术和产品，上海金畔生物科技有限公司邀请Cygnus高级研发总监David Cetlin （原MockV Solutions CEO）通过网络视频的形式举办线上Webinar介绍关于MVM-MVP试剂盒及相关技术原理，并且观众可以现场与David互动答疑解决对该产品和技术存在的疑问。本次线上研讨会暂定于2020年4月底（具体时间会另行通知），如有感兴趣的客户请通过上海金畔生物科技有限公司公众号报名参加。

报名方式：扫描文末下方二维码关注上海金畔生物科技有限公司微信公众号，在公众号底部菜单“客户服务”→“资料索取”中填写表单并在最后一栏中备注“MVM”，提交即可完成报名，我们会提前将参会详情通知已报名的客户。

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

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通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

筑波大学生 命环境系1）、北海道大学 医学研究院 微生物学免疫学领域2） 

浦山俊一1）、福原崇介2）

◆前言

人类发现病毒的存在大约是在1900年，其契机是动植物间出现的一种原因不明的传染病。在寻找致病病原体的过程中，由于它比当时已知的最小病原体（微生物）更小，且具有异质性，因此被命名为"病毒"。此后，研究人员在所有生物体内都发现了各种不同类型的病毒，现在病毒被认为是细胞生物体内普遍存在的绝对寄生因子。

RNA病毒是以RNA为基因组的病毒的总称，从狭义上讲，是指去除在其生命周期内同时利用DNA的逆转录病毒（例如HIV的基因组是RNA，但它能经过逆转录进入宿主的基因组DNA中）的病毒群。它包含多种对人类，家畜和植物等经济型生物有重大危害的病毒，例如典型的SARS-CoV-2、流感病毒、寨卡病毒和丙型肝炎病毒。

对于肉眼无法看见且难以培养的RNA病毒，”发现”其存在至关重要。不仅是医疗领域，还需要更进一步展开关于这些RNA病毒的起源和传播的全健康（one health）研究，并从包含RNA病毒的全球生态系统的角度对其进行认识。因此，基于各种目的的RNA病毒检测方法也应运而生，本文将基于"双链RNA"的方法介绍其应用于高等动物组织的案例。

 

◆利用双链RNA检测RNA病毒的原理

不携带RNA病毒的细胞几乎不存在长双链RNA。但是，存在RNA病毒时，RNA病毒基因组的复制过程中会产生双链RNA，因此，如果在生物样品中检测出双链RNA，则表明存在RNA病毒1），此处的关键在于双链RNA的纯化技术。纯化主要使用的是利用双链RNA结合于纤维素树脂的性质的柱色谱法1-3），和使用双链RNA结合蛋白和抗双链RNA抗体的方法，以及通过DNA和单链RNA的分解留下双链RNA的方法。通过解码得到的双链RNA，也可以选择性地确定RNA病毒基因组4-8）。

 

◆动物组织中的双链RNA的纯化和解码

由于几乎没有从高等动物样品纯化双链RNA的报告，因此我们首先使用被广泛使用的纤维素树脂进行纯化。使用市售肉糜的测试结果表明，rRNA的读数比例的约占90%，通过分子内互补结合，残留了大量具有部分双链RNA结构的rRNA（图1左）。相同的方法应用于真菌、植物、昆虫时，rRNA读数比例仅为百分之几，这表明这是高等动物样品特有的课题。因此，将使用相同方法纯化的双链RNA溶液进一步用市售的rRNA去除试剂盒进行处理，可将rRNA读数比例减少到20%左右（图1右）。

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

图1. 肉糜样品中，普通的双链RNA纯化会残留大量rRNA

使用自制核酸纯化柱通过纤维素树脂从肉糜样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果，将获得的双链RNA组分进行分组，准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品，分别通过FLDS法9）进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例。

但是，使用rRNA去除试剂盒会使每个样品的成本增加1万日元左右，处理过程也会变得繁琐且耗时。因此，使用ISOVIRUS Ⅱ（使用纤维素树脂纯化双链RNA用试剂盒， ISOVIRUS的动物样品版）对人肝脏样品进行测试。结果表明，使用ISOVIRUS Ⅱ时，即使不经过rRNA去除工序，也可将rRNA读数比例抑制在20%左右（图2A左）。当ISOVIRUS Ⅱ与rRNA去除试剂盒配合使用时，可进一步降低rRNA读数比例至10%以下（图2A右）。并且，该样品来源为HCV阳性患者，因此也能检测出HCV读数（图2B）。

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

图2. ISOVIRUS Ⅱ的rRNA残留量少

使用ISOVIRUS Ⅱ通过纤维素树脂从人肝脏样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果，将获得的双链RNA组分进行分组，准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品，分别通过Modified dsRNA-seq法4）进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例，并通过绘图计算HCV的比例。

◆结语

双链RNA作为RNA病毒感染的分子标志物，近50年来一直为提高RNA病毒的探索效率做出贡献。实际上，笔者以前报告的Modified dsRNA-seq方法已成功捕获以极低复制率潜藏在人体器官中的HCV。与采用一般的RNA病毒探索方法相比，检测灵敏度高数百倍，且无需花费巨额测序成本就能全面检测RNA病毒。

直到最近，双链RNA纯化还没有试剂盒化，而是作为每个研究室传承的特殊技术。但是，随着ISOVIRUS系列的推出，它成为了人人都能使用的技术。并且，ISOVIRUS Ⅱ还有望消除昂贵且繁琐的rRNA去除工序，大幅降低从高等动物样品中探索RNA病毒的成本。

在RNA疫苗的生产中，需要去除作为副产物产生的双链RNA，以避免不必要的自然免疫激活10）。ISOVIRUS系列能够稳定地回收可能仅微量存在的HCV来源双链RNA，并且具有数百ng量级的高结合容量，还有望用于上述RNA疫苗的生产。

◆参考文献

 1. Morris, T. J. and Dodds, J. A. : Phytopathology, 69, 854 （1979）.

 2. Marquez, L. M. et al. : Science, 315, 513 （2007）.

 3. Okada, R. et al. : J. Gen. Plant Pathol., 81, 103 （2015）.

 4. Izumi, T. et al. : Viruses, 13, 1310 （2021）.

 5. Hirai, M. et al. : Microbes Environ., 36, ME20152 （2021）.

 6. Roossinck, M. J. et al. : Mol. Ecol., 19 Suppl 1, 81 （2010）.

 7. Decker, C. J. et al. : Viruses, 11, 943 （2019）.

 8. Yanagisawa, H. et al. : Viruses, 8, 70 （2016）.

 9. Urayama, S. et al. : Mol. Ecol. Resour., 18, 1444 （2018）.

10. Rosa, S. S. et al. : Vaccine, 39, 2190 （2021）.

◆注释

双链RNA

两个具有互补序列的RNA分子形成碱基对，具有双螺旋结构的RNA分子。

读数（比例）

指通过新一代测序技术获得的庞大数量的碱基序列之一。在庞大的读数中，表示特定序列所占的百分比时，称为"读数比例"。

HCV

丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus）的简称。多数的慢性感染患者被认为会发展成肝硬化或肝癌。

◆相关产品

双链RNA纯化试剂盒

产品编号

产品名称

产品规格

310-08811

ISOVIRUS

20次用

312-09091

ISOVIRUS II

20次用