ViraSafe™ 慢病毒表达系统——Cell BioLabs慢病毒表达载体

发表于2024年2月19日由上海金畔生物科技有限公司

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合持久表达、免疫反应小等优点。市场上的慢病毒是由人类免疫缺陷病毒（HIV），通过去除env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装，从而更安全，宿主范围更广，还能增加病毒的滴度。

慢病毒载体的发展经历了3个阶段：第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转绿和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个独立的质粒表达系统上，即包装质粒（一个强启动子如CMV作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达）、包膜质粒（包含VSV-G基因）和载体质粒（包含目的基因），用这三种质粒共同转染包装细胞如人胚肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第二代慢病毒载体系统从安全性角度又删去了HIV的所有附属基因。第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进，如删除了U3区的3′LTR和tat基因。

安全性始终是大家关心的问题，毕竟是HIV改造过来的，不容许有一点闪失。国内的实验室很多都达不到P2的级别，甚至是一堆人挤在一个房间里做各种各样的实验。Cell BioLabs的新一代慢病毒表达系统对广泛应用的第三代慢病毒进行了改进，将Rev与gag和pol基因分离，这意味着要产生原始的病毒，还需要更多的重组步骤。这样完整的ViraSafe™ 慢病毒表达系统包含5个载体（包括一个对照载体），安全性更高。

慢病毒的表达流程一般如下：将目的基因片段克隆到表达载体上；将重组表达载体，与包装混合物（通常是几个质粒的混合物）共转染293细胞；收集病毒上清，测定滴度；感染目的细胞，瞬时表达目的蛋白或用抗生素筛选稳定细胞株；分析目的蛋白。看上去并不复杂，但中间许多步骤需要不断优化。而且慢病毒有一个软肋，就是病毒滴度不高。你可能还需要纯化或浓缩，才能得到10⁸TU/ml的慢病毒。

与目前市场上流行的新一代慢病毒相比，ViraSafe™ 慢病毒表达系统进行了进一步的优化。如在载体质粒上插入了cPPT（增加基因表达水平）及WPRE（增加感染滴度），在一个包装载体中插入腺病毒VA基因以增加感染滴度；同时在整个系统载体的多个部分做了一些基因的优化或删减和插入以增加病毒的安全性。经过这样的优化，ViraSafe™ 最新一代慢病毒表达系统的包装容量增大到10kb，在应用上更广泛；其感染细胞的滴度及外源基因的表达水平均提高，这也在一定程度上弥补了慢病毒在基因治疗领域内的不足；由于对整个慢病毒系统的多层面改造，降低了载体间的同源率和重组机率，更安全。如果您的实验需要长期稳定的基因表达或沉默，而目的细胞又很难转染，那ViraSafe™ 慢病毒表达系统将是您的最理想选择。

产品名称	货号	产品说明
ViraSafe™ Universal Lentiviral Expression System	VPK-211-ECO	通用慢病毒表达系统，MCS位点前无启动子，克隆时可插入特异性启动子序列，分双嗜和多嗜两种
	VPK-211-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Puro)	VPK-212-ECO	EF-1α真核细胞启动子类型，带有Puro抗性筛选标记，分双嗜和多嗜两种
	VPK-212-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Neo)	VPK-213-ECO	EF-1α真核细胞启动子类型，带有Neo抗性筛选标记，分双嗜和多嗜两种
	VPK-213-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Hygro)	VPK-214-ECO	EF-1α真核细胞启动子类型，带有Hygro抗性筛选标记，分双嗜和多嗜两种
	VPK-214-PAN

另外，根据您实验的不同需求，ViraSafe™ 设计出不同的启动子类型供您选择。有不含有启动子的通用型慢病毒表达载体，您可以用来表达特异性启动子引导的基因；还有真核基因强力启动子CMV启动子类型以及用于表达shRNA的RNAi以及miRNA的启动子供您选择。

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案，ViraSafe™ 慢病毒表达系统有多种样式供您选择；专门针对慢病毒滴度低的软肋而专门设计的ViraBind™慢病毒浓缩&纯化试剂盒，能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒；还有多种慢病毒快速定量以及感染滴度滴定检测方案；Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及高效转染试剂供您选择，如果您对慢病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒

发表于2024年2月17日由上海金畔生物科技有限公司

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点，是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中，由于加入了GFP标记蛋白，因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外，还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便，且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示，首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解，然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒，从而分离出蛋白核酸复合物，洗脱下慢病毒后进一步降解，然后标记其病毒核酸，通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据，对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液，定量步骤快捷，可以在45-60min内获得数据。检测灵敏，可以从100ul慢病毒上清中检测出10¹⁰VP/ml的慢病毒，足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

产品名称	货号	产品说明（点击查看说明书）
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit	VPK-112	荧光法检测，20次分析

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案，ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择；多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案；ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒，解决了慢病毒低滴度的软肋；Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择，如果您对慢病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用

发表于2024年1月25日由上海金畔生物科技有限公司

随着全球对新冠病毒治疗药物广泛而深入的研究，抗双链RNA抗体成为抗病毒药物研发过程中不可或缺的重要工具。本文综述了一种新冠病毒治疗药物的研发进展，通过利用小鼠抗双链RNA单克隆抗体检测新冠病毒感染后的双链RNA，从而发现了一系列潜在抗病毒药物在抑制SARS-CoV-2及其突变株对细胞感染的有效性。

SARS-CoV-2，俗称COVID-19，是一组正链、单链RNA (ssRNA)病毒，这类病毒还包括丙型肝炎病毒、登革病毒、中东呼吸综合征病毒和西尼罗河病毒。韦伯等人在2006年的一篇论文¹中证明了，被这些正链RNA病毒感染的细胞，在病毒复制过程中会产生双链RNA (dsRNA)，可作为中间体被检测到。SCICONS抗双链RNA抗体J2可检测这种中间体，从而能够确认病毒感染，以及病毒在宿主细胞内的复制。

在一项加拿大和美国的联合研究中，科学家们通过靶向II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP) TMPRSS2阻止COVID-19病毒感染，TMPRSS2是一种蛋白酶，介导COVID-19刺突蛋白的切割，在这项新的靶向治疗方法研究中，J2克隆被用来评估抗病毒化合物的效力，这些抗病毒化合物是通过阻止病毒进入宿主细胞而预防感染的。

Shapira等人，开发了一个新型小分子TMPRSS2抑制剂文库作为潜在的治疗药物²，科研人员用潜在治疗剂在肺上皮细胞系(Calu-3)和人活组织来源的结肠膜上进行预处理，然后感染多种SARS-CoV-2毒株。通过免疫荧光对固定细胞染色，用J2抗体检测双链RNA (J2克隆)和核衣壳蛋白的存在，成功检测到COVID-19感染。通过荧光染色方法监测治疗剂文库中化合物感染减少的百分比，反应剂量分析及进一步研究显示，小分子化合物N-0385是一种纳摩级、广谱的SARS-CoV-2冠状病毒抑制剂，对备受关注的B.1.1.7(英国)和B.1.351(南非)两种变异株仍然有效。在对K18-h ACE2转基因小鼠SARS-CoV-2疾病模型的研究数据表明，在感染早期通过鼻腔给药化合物N-0385，临床效果改善明显，存活率可达100%，而对照组仅为20%。

SCICONS小鼠抗双链RNA单克隆抗体（J2）已成为双链RNA检测的金标准。它可以用于检测多种病毒的双链RNA中间产物，如丙型肝炎病毒、登革病毒、鼻病毒、基孔肯雅病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、典型猪瘟病毒、雀麦花叶病毒和培养细胞中的病毒，也可以用于石蜡包埋的组织样品检测。更多关于小鼠抗双链RNA抗体J2的信息可在Nordic MUbio公司官网查阅，产品代码为10010200/10010500，为了方便大家查找，小编汇总了SCICONS产品信息表：

货号	英文品名	中文品名	规格
10010200	Mouse anti double-stranded RNA (J2)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)	200 µg
10010500	Mouse anti double-stranded RNA (J2)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)	500 µg
10040200	Mouse anti double-stranded RNA (J5)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)	200 µg
10040500	Mouse anti double-stranded RNA (J5)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)	500 µg
10020200	Mouse anti double-stranded RNA (K1)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)	200 µg
10020500	Mouse anti double-stranded RNA (K1)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)	500 µg
10050100	Mouse anti double-stranded RNA (J2, J5 and K1) Comparison Kit	小鼠抗双链RNA单克隆抗体（J2,J5 and K1)组合试剂	3 x 100 µg
10613002	Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)	双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)	Kit
10623002	Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)	双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)	Kit
10623005	Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)	双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)	Kit
10613005	Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)	双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)	Kit
10030010	Mouse anti double-stranded RNA (K2)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)	10 ml
10030005	Mouse anti double-stranded RNA (K2)	小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)	5 ml

SCICONS是一家提供与双链RNA分子杂交的小鼠单克隆抗体的厂家，客户遍布世界很多国家和地区，在美国有超过一半的州都在使用SCICONS dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用的单克隆抗体。SCICONS在1990年便开始利用杂交瘤细胞系生产抗双链RNA（anti-dsRNA）的单克隆抗体，此类抗体的特异性非常强，包括J2、K1和K2小鼠单克隆抗体。SCICONS的客户包括许多研究机构的学者，发表的文章超过200多篇。

SCICONS于2021年4月13日被Nordic-MUbio BV收购，Nordic-Mubio是一家专注于免疫学的研究试剂公司，总部设在荷兰的Susteren，公司拥有广泛的产品组合，可应用于流式细胞术、细胞生物学、免疫学、癌症研究、干细胞等研究领域。

上海金畔是Nordic MUbio品牌中国区一级代理，为客户提供完善的技术支持与售后服务。关注“金畔生物科技”官方公众号，更多海量免疫学产品等您发现！上海金畔生物科技有限公司集结了全球高质量抗体及抗体相关产品和服务供应商，如Nordic-MUbio、Lifespan、MyBioSource、KPL、Everest和Cal Bioreagents等。品牌知名、产品优质、种类齐全，为科研工作者以及生物制品生产企业提供一站式的服务。如对上述产品感兴趣，欢迎随时拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录上海金畔生物科技有限公司官网www.jinpanbio.cn查询订购。

Reference

Weber F , Wagner V , Rasmussen S B , et al. Weber, F, Wagner, V, Rasmussen, SB, Hartmann, R and Paludan, SR. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. J Virol 80: 5059-5064[J]. Journal of Virology, 2006, 80(10):5059-5064.
Shapira T , Monreal I A , Dion S P , et al. A novel highly potent inhibitor of TMPRSS2-like proteases blocks SARS-CoV-2 variants of concern and is broadly protective against infection and mortality in mice. 2021.

新品上市 | 腺相关病毒（AAV）滴度检测试剂盒

发表于2024年1月22日由上海金畔生物科技有限公司

常用的病毒基因传递载体包括逆转录病毒（RV）、腺病毒（AdV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）和单纯疱疹病毒（HSV）。其中，AAV属于细小病毒科，是其中最小的单链和无囊膜DNA病毒，目前已发现的血清型有11种。在所有不同血清型的AAV中，重组AAV-2是最常用的一种，它可以通过辅助病毒或Cell Biolabs提供的AAV Helper-Free System来体外生产出高滴度的重组病毒。AAV-2可以感染分裂细胞和非分裂细胞，并能在人类宿主细胞中维持，具有一定的基因稳转潜力。由于AAV-2是一种天然缺陷型病毒，需要在反式结构中提供若干因子才能进行生产性感染，因此被公认为最安全的病毒载体。近年来，利用DNA重组技术开发了一种新型的载体AAV-DJ，是从8种不同血清型AAV重组而来的一个混合衣壳，使其能在各种不同细胞和组织中都具有显著较高体外感染效率的载体。重组的AAV-2和AAV-DJ病毒都可通过CsCl梯度超离法、碘二醇密度梯度超离法或Cell Biolabs的AAV纯化试剂盒来纯化。

利用病毒载体来转导基因必须要准确地测量病毒滴度。传统检测AAV滴度是通过DNA斑点杂交或类似方法来定量AAV基因组拷贝数（GC）。然而这些方法耗时耗力，且稳定性不佳。对于已经高度纯化的病毒样品，也通常用其在260nm的吸光度来估算病毒粒子总数，但这种方法不适用于未纯化的病毒上清，因为其中的杂质成分会影响260nm的光吸收度。

上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs提供了一种快速全面的用于检测纯化后的AAV滴度的试剂盒QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit。该试剂盒包含一个96孔板和足够检测96个样本的试剂，包括已灭活的AAV标准品，通过标准曲线能够计算出样品中纯化后的AAV滴度。该试剂盒检测灵敏度为6.25×108 GC/mL，能够检测AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-5，AAV-6，AAV-8，AAV-9，AAV-10，AAV-DJ和AAV-DJ/8多种血清型的AAV滴度，并且适用于所有表达系统生产的AAV。

检测原理

AAV衣壳是由VP1、VP2和VP3三种蛋白质混合构成，平均每一个病毒粒子中包含60个VP分子，其比例为5 VP1 : 5 VP2 : 50 VP3。试剂盒中提供的96孔板已预包被了可以结合三种VP蛋白的捕获抗体，当AAV样品或标准品加入到96孔板中，其AAV衣壳蛋白就会与捕获抗体结合。经过孵育和洗板等步骤后，再分别加入AAV VP衣壳抗体和HRP标记的二抗，而未结合的抗体将被洗脱下来。经底物显色后，测定450nm处的吸光度，最后通过AAV标准曲线计算未知样品中AAV衣壳蛋白浓度，进而计算出样本中AAV滴度。

下图展示了AAV滴度检测试剂盒的标准曲线结果。

新品上市 | 腺相关病毒（AAV）滴度检测试剂盒

产品特点

通过检测纯化后的重组AAV衣壳蛋白来确定AAV滴度；
AAV定量结果由标准酶标仪读取；
试剂盒中提供灭活的AAV标准品；
适用于多种血清型AAV滴度测定，包括AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-5, AAV-6, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-DJ and AAV-DJ/8

产品信息

货号	品名	规格
VPK-5146	QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit	96 assays
VPK-5146-5	QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit	5 x 96 assays

新品上市 | 腺相关病毒（AAV）滴度检测试剂盒

Cell Biolabs公司坐落于美国加利福尼亚州圣地亚哥市，一直致力于开发生命科学研究领域的技术和工具，并将所开发的创新性技术成果商业化。Cell Biolabs孜孜不倦的完善产品，以期使细胞功能和疾病机制研究达到新高度。Cell Biolabs公司的产品独具特色并且处于行业前沿水平，全球众多大学、政府研究机构、生物、制药企业的科研实验室均在使用。上海金畔生物科技有限公司是Cell Biolabs中国一级代理，为用户提供完善的技术支持与售后服务。如您对上述产品感兴趣，欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

引用文献

1. Rabinowitz, J, and Samulski, R. J. (1998) Curr. Opin. Biotechnol., 9, 470-475.

2. Summerford, C., and Samulski, R. J. (1999) Nat. Med., 5, 587-588.

3. Clark, K., Liu, X., McGrath, J., and Johnson, P. (1999) Hum. Gene Ther., 10, 1031-1039.

4. Sonntag, F., Schmidt, K., and Kleinschmidt, J.A. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A., 107, 10220-5.

高效率低成本的GMP转染方案，解决细胞和基因治疗生产中的关键问题！

发表于2024年1月21日由上海金畔生物科技有限公司

病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性，全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的，其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒（AAV）载体常被用于基因治疗，而慢病毒（LV）载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的，而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一，对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内，但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步，但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此，优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感，从中筛选出适合病毒生产的混合配方，将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力，Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂，它不仅仅是基于PEI或脂质体，而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物（LPNC），能够高效地结合和包裹DNA，将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中，然后将其从细胞核内释放，以便同时满足2-4个不同的质粒的表达，这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时，Mirus还研发出了一种完全合成的（无动物源）转染增强剂（Enhancer），与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时，可以进一步提高病毒滴度。另外，为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求，Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品，以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明，Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台（贴壁和悬浮）、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比，在不使用增强剂的情况下，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后，在合适的培养条件下，病毒产量甚至能够提高10倍以上！（结果见下图1-5）