什么是生物共轭技术？

生物缀合物是指一个分子通常通过共价键连接到另一个分子上，以形成由两个连接在一起的分子组成的复合物。生物共轭技术在开发针对特定目标的衍生蛋白质、DNA、RNA和碳水化合物的新型研究方面具有广泛的应用，例如配体发现、疾病诊断和高效筛选。这是一个具有广阔前景的研究领域。

生物共轭技术概述：

生物共轭是两个生物分子共价键合的过程。常见的生化偶联包括赖氨酸氨基酸残基的胺偶联、半胱氨酸残基的硫氢基偶联，以及常常由光化学引发的自由基反应。生物共轭的产物是生物共轭物。
最常见的生物偶联是小分子的偶联，例如生物素与蛋白质的偶联；以及蛋白质与蛋白质的偶联，例如抗体与酶的偶联。其他不常见的偶联分子，如寡糖、核酸、合成聚合物：聚乙二醇、碳纳米管。生物缀合物包括抗体-药物复合物 (ADC)、聚乙二醇化蛋白、siRNA 复合物和疫苗复合物。
小分子属于半抗原，仅具有反应性但不具有免疫原性。它们只有与载体（通常是蛋白质，也有多肽）偶联形成完整抗原后才具有免疫原性，进入动物体内后才会产生抗体。 。载体蛋白是能够自行引发免疫反应的大分子。许多不同类型的载体蛋白可以与小分子缀合以制备完整抗原。常用的载体包括牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白等。载体蛋白的选择主要涉及其溶解度、大小、偶联基团、免疫原性、成本等因素。目前市场上应用广泛的牛血清白蛋白BSA主要是由于BSA化学性质稳定，不易变性，分子中含有多种氨基，且赖氨酸含量高，廉价易得。但 BSA 限制了其在一些免疫测定实验中作为封闭剂的用途。第二个选择是匙孔血蓝蛋白KLH和卵清蛋白OVA。

小分子半抗原与载体的偶联方法：

1、对于带有羧基或氨基的化合物，采用碳二亚胺法和混合酸酐法；
2、含有巯基的化合物，采用马来酰亚胺法；
3、对于分子结构中带有氨基的化合物，戊二醛法是常用的方法。

生物共轭物的应用：

1.生化评估：
缀合小分子可用作严格生化分析的探针，生物素等非荧光小分子也可用作机械探针。

2.诊断应用：
临床样本的定性和定量分析对于早期疾病诊断至关重要，抗体-抗原相互作用的高特异性避免了样本纯化，可广泛应用。

3、工业应用：
生物共轭可用于很多行业，可以用于食品行业，如异构化富马酸和苹果酸，用于食品残留检测；医药工业利用固定化酶进行药物合成，也可用于药物检测。代理检测等

什么是生物光学标记？

生物光学标记是指用具有光学特性的标记物对生物分子进行标记，从而达到检测和识别的目的。根据应用光学特性的不同，通常可分为荧光分子标记、荧光蛋白标记、生物发光标记、化学发光标记等。根据标记目的，包括生物分子标记、生化标记、细胞学标记、形态标记等。

生命分子的探测、生命过程的观察、特定生物组织的识别通常因其微观性和隐蔽性而难以直接观察，甚至超出仪器的检测范围。它可以“脱颖而出”并借助相应仪器进行检测。

对目前检测方法可以检测到的特定生物分子、细胞或组织进行标记并检测分子和纳米颗粒，然后通过检测分子/颗粒的数量和分布来获取特定分子、细胞或组织的特征，进而获得某些区域以及细胞或生物体内分子、生化、生理指标的反应和信号。这种标记过程通常称为生物标记。生物光学标记是指用具有光学特性的标记物对生物分子进行标记，从而达到检测和识别的目的。根据应用光学特性的不同，通常可分为荧光分子标记、荧光蛋白标记、生物发光标记、化学发光标记、根据标记目的，包括生物分子标记、生化标记、细胞学标记、形态学标记等。

生物光学标记物，由于采用光学方法，借助成熟的光学高灵敏度检测仪器，可以实现高对比度、高分辨率、高灵敏度、高信噪比，方便快捷地进行检测。选择作为主要生物标志物方式。特别是荧光蛋白发现后，生物光学标记得到了快速的应用发展。 Osamu Shimomura、Martin Charfie 和 Roger Tsien 因其对绿色荧光蛋白的发现和研究而获得 2008 年诺贝尔化学奖。生物光学标签现在广泛用作生命科学和医学研究中的示踪剂。

生物光学标记研究和应用的历史
在生物研究中，科学家经常使用发出荧光的荧光分子作为生物标记。通过将这种荧光分子化学连接到其他不可见的分子上，以前不可见的部分变得可见。生物学家一直在使用这种标记方法将原本透明的细胞或细胞器“拉”出暗显微镜视野。

传统荧光分子发光时会产生有毒的氧自由基，导致观察到的细胞死亡，这就是“光毒性”。因此，在绿色荧光蛋白发现之前，科学家只能通过荧光标记的方式进行研究。死细胞的静态结构，或者其毒性作用不得不暂时忽略，而活细胞只能观察很短的时间，而荧光蛋白的光毒性很弱，非常适合标记各种活细胞。

1962 年，这种荧光蛋白在一种名为维多利亚多管发光水母的水母中被发现。其基因产生的蛋白质在受到蓝色波长光激发时会发出绿色荧光。发光过程还需要发光蛋白水母发光蛋白的帮助，而这种蛋白还需要与钙离子（Ca）相互作用。

GFP 的光毒性非常弱，非常适合标记活细胞。然而，从绿色荧光蛋白被发现到用于标记生物样品，却花了20多年的时间。 1993年，Martin Schalfi通过基因重组成功使水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）产生绿色荧光蛋白。他不仅证实了绿色荧光蛋白与生物体的相容性，而且建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法，而现代许多重大疾病都与基因表达异常有关。

后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对其进行了大刀阔斧的化学改造，不仅大大增强了其发光效率，而且开发出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白。 ，使荧光蛋白真正成为生物学家根据需要进行选择的工具箱。生物实验室常用的荧光蛋白大多是钱永健修饰的变体。

有了这些荧光蛋白，利用光学仪器，科学家们似乎在细胞中安装了“灯塔”，让它们能够实时监测各种生命过程。通过沙尔菲的基因克隆思想，科学家迄今已培育出荧光小鼠和荧光猪。
此外，除了上述荧光分子和荧光蛋白标记外，2000年以来，随着生物纳米技术的发展，一些新型的、生物相容性的光学纳米标记也得到了研究和开发，如上转换纳米粒子、量子点等。 、长延时荧光粒子等都已被研究和利用。它被用作细胞和活体的生物标记，作为生物光学成像“传感”的有力的工具。

生物光学标记的类型和应用
荧光分子/纳米颗粒标记
荧光分子包括有机试剂或金属螯合物；荧光纳米粒子包括上转换、量子点等，在紫外-可见-近红外区域具有较强的特征荧光。用这种分子/纳米颗粒标记细胞和活体后，可以实现光学示踪检测，或者激发和发射波长、强度、寿命和偏振等荧光特性可以随着极性、折射率等环境特性的变化而敏感地改变、粘度和生物检测可以利用这一特性进行。荧光分子/纳米颗粒标记设计灵活，应用方便。

生物发光标记
生物发光标记是利用荧光素酶（Luciferase）基因来标记细胞或DNA的生物标记方法。标记后，细胞合成荧光素酶，然后添加外源荧光素酶。下面，荧光素氧化后发光。该方法使研究人员能够直接监测生物体中的细胞活动和基因行为。通过该系统，可以观察活体动物中肿瘤生长和转移、传染病的发展以及特定基因的表达等生物过程。由于其操作极其简单、结果直观、灵敏度高，已广泛应用于生命科学、医学研究和药物开发。

荧光蛋白标记荧光蛋白
后将基因片段与目的基因连接，转染细胞，正常表达后，可在激发光下用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜观察检测。荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。它对活细胞无害，并且可以长时间观察。因此被广泛应用于转基因动物、融合标记、基因治疗、活细胞中蛋白质功能定位和迁移变化、病原菌侵入活细胞的分子过程等研究。荧光蛋白作为新一代基因转移报告基因和/或定位标记在生命科学研究中受到越来越多的关注

化学发光标记
将可发光的化合物附着到待检测分子（蛋白质、核酸等）上的方法。也可以连接半抗原（如生物素等），然后与酶标抗半抗原抗体或亲和素结合，与半抗原上的酶标抗体或亲和素结合。可以催化化学发光底物发生化学变化而发光。例如，抗体分子用吖啶酯标记，被触发器激活后发光，用于检测固相抗原。

生物标志物的组学应用

生物标志物是一类可以客观评价的特征性生化指标，通过其测量可以了解生物体的生物学过程。检查疾病的特定生物标志物可以在疾病的诊断和预防中发挥关键作用。

在医学研究领域，生物标志物的研究思路一般分为三个阶段：Discovery、Verification、Validation。生物标志物的筛选通常需要利用高通量组学方法对大规模临床样本进行代谢组学或蛋白质组学测试，筛选出具有统计学意义的差异代谢物或蛋白质，再经过一系列复杂的生物信息学分析筛选出目标生物标志物。在接下来的验证阶段，需要对较小范围的生物标志物进行靶向蛋白质组学或靶向代谢组学的大样本量验证，统计分析，计算靶标标志物的特异性和敏感性。如果你想让自己的研究成果更加完整，还可以使用临床样本，结合临床数据进行补充验证，如ELISA、WB等。

2017年，德国格赖夫斯瓦尔德大学在《Gut》杂志（IF=17.016）上发表的题为“Metabolic biomarkersignaturetoDifferentpancreaticductaladenocarcinomafromchronicpancreatitis”的研究就是利用代谢组学技术确定生物标志物的典型例子。

临床上，胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤之一。慢性胰腺炎是胰腺癌的危险因素，临床上很难区分两者，很容易导致早期胰腺癌的误诊和延误治疗。由于原始标记物效果不佳，这一系列事实促使研究人员努力寻找替代生物标记物。

在这项研究中，总共招募了914名受试者，包括胰腺导管腺癌（PDAC，271名）、慢性胰腺炎（CP，282名）、肝硬化（LC，100名）和健康献血者（BDs）以及261名对照样本术前患有非胰腺疾病的患者，利用LC-MS和GC-MS包括脂质组学（非靶向分析/类固醇/脂质）在内的多个代谢组学平台对914例样本进行了检测。采用三阶段生物标志物开发策略（探索集/训练集/测试集）总共鉴定了 477 种代谢物。

最后，根据代谢组学数据的结果发现了九种潜在的生物标志物。这9种代谢物与现有的胰腺癌诊断血液指标CA19-9结合使用，组合的标志物组甚至可以检测98%的生物标志物。胰腺癌切除准确率达90.4%。组合标志物的 AUC 显着高于 CA19-9 的 AUC（0.94 vs. 0.85，p <0.001）、敏感性（89.9% vs. 74.7%，p <0.01）和特异性（91.3% vs. 77.5%， p <0.05）也显着改善。

不仅是代谢组学，在一些疾病生物标志物的研究中，蛋白质组学的应用也越来越广泛。多组学技术的应用已是大势所趋。接下来，我们通过另一个研究实例向大家介绍多组学技术在生物标志物筛选过程中的作用。

德国格赖夫斯瓦尔德大学2017年的一项研究结果发表在《BMC Medicine》杂志上（IF=8.097）。标题为“实验性人类甲状腺毒症模型的血浆蛋白质组和代谢组特征”。研究人员旨在筛选表征人血浆促甲状腺激素（TSH）和游离甲状腺素（FT4）特征的生物标志物。利用甲状腺毒症模型进行研究，并通过随机森林的两阶段交叉程序，验证筛选的生物标志物是否可以区分甲状腺功能异常。

根据代谢组和蛋白质组数据统计，共鉴定出380种代谢物和497种人类蛋白质。为保证数据的可用性，通过过滤分析，仅选择缺失值小于40%的代谢物和蛋白质进行后续分析。也就是说，下一步将分析 349 种代谢物和 437 种蛋白质。

为了寻找新的生物标志物来对TH状态进行分类，研究人员通过两阶段交叉验证程序建立了随机森林分类器，以全面分析差异代谢物和差异蛋白。最终获得了包括代谢物和蛋白质在内的15种物质。 30次验证结果均表现出稳定且良好的分类能力，可作为潜在的Biomarker。