什么是点击化学？

点击化学是2001年诺贝尔化学奖得主K. Barry Sharpless提出的一系列反应，其核心是开发出一整套基于CXC的含杂原子的连接单元。组合化学新方法利用少量简单、可靠、高选择性的化学转化来获得更广泛的分子多样性。

点击化学的原理是在一定的环境条件下（温和、有水），一对官能团快速、选择性地相互反应（“点击”）。也就是说，两个相容的点击功能基团A和B被激活，激活的两个分子形成稳定的偶联体。

常见的点击化学反应

自2001年点击化学被提出以来，点击化学已广泛应用于合成化学、生物靶点、药物设计、ADMET、酶学研究、基因组学、蛋白质组学和免疫学等多个领域。

蛋白质的二级结构，特别是α-螺旋和β-折叠，是生物相互作用的关键。利用点击化学使非天然氨基酸侧链上的叠氮基与炔基或氰基形成的五元杂环，可以达到稳定多肽中此类二级结构的目的，从而提高其生物活性例如，经过分子模拟优化后，此类杂环结构已成功应用于生物分子cJun（转录过程中的一种α-螺旋）。来源二聚体）和抗菌肽。

基于活性的蛋白质分析（ABPP）是研究重要药物靶蛋白结构和功能的主要方法之一。它是利用活性位点导向探针研究蛋白质结构和功能的新技术。采用相对简单明了的方法，在分子和细胞水平上研究活性小分子与生物大分子之间复杂的相互作用，从而从分子水平揭示生物体在生理或病理条件下的关键调控机制。 Cravatt 和他的合作者通过点击化学将活性位点定向探针与蛋白质连接起来，从而能够实时观察细胞环境中蛋白质活性的变化。

点击化学可分为两类：

1.铜催化反应的类型

铜 (I) 催化的叠氮化物-炔点击化学反应 (CuAAC)

特征

1）小叠氮化物和炔烃具有优异的底物性质
2）测试适用条件的优化（类型和铜源、还原剂和铜配体）
3）适合不干扰铜毒性的实验（不推荐用于体内或体内）活细胞标记）
4）反应速度最慢（与其他两种反应相比）

2.无铜反应型

力诱导叠氮-炔基偶联反应（应变促进叠氮-炔点击化学反应，SPAAC）

特征

1）小分子叠氮化物的检测比CuAAC更快
2）不需要铜离子，无毒
3）没有催化剂或配体，因此不需要大量的条件优化

四嗪反式环辛烯连接 (TCO)

点击化学特征

1）快速点击化学反应，适合体内细胞标记和低浓度反应。
2）无需铜离子，无毒

点击化学在生物医学中的应用

什么是点击化学和生物正交化学？

点击化学：一种基于杂原子连接（CXC）快速有效合成有用新分子的化学合成方法。 [1]

生物正交化学：利用点击化学原理在生命系统内部发生的化学反应，而不干扰天然生化过程。

2001年，对自然界最喜欢的分子的研究表明，与碳-碳键相比，分子更倾向于形成碳-杂原子键。 “点击化学”概念的灵感来自于核酸、蛋白质和多糖是通过碳-杂原子键结合在一起的缩合聚合物。点击化学是一种化学合成方法，可以快速有效地合成基于碳杂原子连接 (CXC) 的有用新分子。

在此之前，化学合成复杂、困难，但收率低。直到第一代点击化学，一价铜催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC）反应被提出，复杂的反应开始通过以图案化反应方式构建功能分子来简化。然而，铜催化剂的细胞毒性限制了CuAAC反应在体外和体内的应用。

此后，化学家发现了一种应变促进的炔烃-叠氮化物环加成（SPAAC）反应，该反应无需细胞毒性铜催化剂即可发生叠氮化物-炔烃反应。该反应已用于在体外和体内标记细胞表面的糖蛋白，没有明显的细胞毒性。

然而，一些化学家对SPAAC的二级反应速率常数并不满意。因此，布莱克曼等人。开发了s-四嗪和反式环辛烯 (TCO) 衍生物的环加成反应之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德 (iEDDA) 反应，可产生比 SPAAC 反应更快的无铜点击化学反应。

图2. 目前使用的点击化学反应的特点，来源：参考文献[3]

点击化学在生物医学中的应用

点击化学在生物医学研究领域取得了重要进展，特别是无铜点击化学，包括 SPAAC 和 iEDDA 反应。在体外研究中，点击化学可以对细胞靶蛋白进行特异性标记，并研究药物靶标与活细胞中药物替代物的相互作用。此外，细胞膜脂质和蛋白质可以在体外选择性标记，并且细胞可以通过点击化学连接在一起。在体内研究中，点击化学使分子成像和药物输送能够高效且有效地进行诊断和治疗。 [3]

接下来，我们介绍点击化学在生物医学研究中的几个具体应用。

用于荧光成像的点击化学

无铜点击化学最有趣的应用之一可能是细胞内感兴趣的目标 (TOI) 蛋白质的荧光成像。 [3]特别是在 iEDDA 反应中，可以使用 TCO-配体缀合物以及随后含有 Tz 的荧光团 (FLTz) 的处理成功地观察活细胞中的先天 TOI 蛋白。

例如，临床药物AZD2281与TCO结合开发了用于研究PARP1蛋白（已知是DNA修复的重要细胞蛋白）的生物探针。 TCO 与抗癌剂紫杉醇偶联，并使用紫杉醇-TCO/Tz-BODIPY FL 组合成功地实现了细胞内微管蛋白的可视化。后来的多配体-TCO 缀合物，如 BI2536、Foretinib、Dasatinib 和 Ibrutinib，也被用于开发靶向各种 TOI 蛋白，如 Polo 样激酶 1 (PLK1)、MET 和 BTK 蛋白。 [3]

图 3. MDA-MB436 细胞中 AZD2281-TCO 和 Texas Red-Tz 之间的无铜点击反应。来源：参考文献[3]

靶向药物输送中的点击化学

点击化学已成为生物体研究中药物靶向递送的强大化学工具。点击化学的快速二阶反应速率常数、简单性和正交性可用于聚合物合成或药物载体开发过程中生物配体的位点特异性修饰。例如，2012 年，Koo 和 Lee 等人。提供证据表明体内点击化学可用于纳米颗粒递送。在该研究中，将负载 Ac4ManNAz 的纳米粒子对肿瘤细胞进行叠氮基标记，并使用含有光敏剂的 DBCO 修饰纳米粒子进行二次肿瘤靶向，依次注射到小鼠体内，叠氮基和 DBCO 之间的 SPAAC 增强了肿瘤靶向性。 [3]

图 4. 点击化学在肿瘤靶向药物递送中的应用。来源：参考文献[3]

基于点击化学的 ADC 合成

Cu(I) 催化的炔烃叠氮环加成反应 (CuAAC) 在抗体药物偶联物 (ADC) 的合成中具有巨大潜力[4]。研究人员现已设计出高效且经济高效的基于 CuAAC 的 ADC 偶联方法，并证明可以快速合成 ADC，从而促进了 GlycoConnect 偶联技术的发展。 GlycoConnect 使用天然糖基化位点实现靶向缀合，并且可以在短短几天内将单克隆抗体转化为稳定的缀合 ADC。该技术基于两个过程：首先是酶促重塑（用叠氮化物进行修饰和标记），然后是基于无铜点击化学的有效负载连接。 Synaffix 已与多家公司合作开发其下一代 ADC 技术平台，其中包括 GlycoConnect。

图 5. 根据许可协议开发的下一代 ADC

ADC Therapeutics 是较早获得 Synaffix ADC 平台技术的公司，也是目前使用该技术开发的产品数量最多的代表，其中ADCT-601已处于临床研究阶段。 [5] 目前，ADC Therapeutics 在实体瘤领域的公开产品 (3/5) 正在使用 Synaffix 的 ADC 技术。

图 6. ADC 治疗产品线

图 7. ADCT-601 的结构

基于点击化学的PROTAC合成

由于反应条件较温和且效率较高，点击化学常用于PROTAC分子的连接体中以连接分子的两端。瑞安·P·伍尔兹 (Ryan P Wurz) 等人展示了这种方法与溴结构域和末端结构域 4 (BRD4) 配体 JQ-1 (3) 以及针对 cereblon (CRBN) 和 Von Hippel–Lindau (VHL) 蛋白的连接酶结合剂的实用性 [6]。

图8.基于Click Chemistry的PROTAC合成，来源：参考文献[6]

基于点击化学的诊断

点击化学还可用于开发用于了解组织发育、疾病诊断和治疗监测的分子工具。许多癌症将膜结合微泡 (MV) 释放到外周循环中，对胶质母细胞瘤 (GBM) 等 MV 进行分析是一种很有前景的疾病诊断方法。例如，李等人。报道了一种结合 iEDDA 型点击化学和小型微核磁共振 (μNMR) 的微流体系统，用于分析 GBM 患者血液中的 MV [4]。

图 9. 单击“基于化学的诊断”。来源：参考文献[3]

概括

点击化学和非铜生物正交反应在生物医学研究领域取得了重要进展。点击化学可以对细胞靶蛋白进行特异性标记，并可用于将细胞粘附在一起，还可以实现高效且有效的分子成像和药物递送，以用于诊断和治疗目的。点击化学还可用于开发DNA纳米催化剂、基因组DNA化学合成、辅助CRISPR-Cas基因编辑、ADC和PROTAC合成等分子工具。总体而言，点击化学已成为生物医学领域和生物医学领域的重要工具。有机化学。

Biopharma PEG 作为全球点击化学试剂的供应商，自豪地培育了这种能量。我们提供用叠氮化物、炔烃、DBCO 和其他环辛炔功能化的 PEG 产品和试剂。

DNA 标记方案——点击寡核苷酸和 DNA 的化学标记

点击化学是一种多功能反应，可用于合成各种缀合物。事实上，任何生物分子都可以使用点击化学方法轻松地用小分子标记，例如荧光染料、生物素等。

点击化学反应发生在两种组分之间： 叠氮化物和炔烃（末端乙炔）。叠氮基和炔基在天然生物分子中几乎从未遇到过。因此，该反应具有高度生物正交性和特异性。如果需要标记寡 核苷酸，可以在许多定制寡核苷酸合成设施和公司订购炔烃修饰的寡核苷酸。

1. 使用下表计算点击化学标记所需的试剂体积。准备所需的储备溶液（见附录）。

   试剂	混合物中的最终浓度	原液浓度
   炔烃修饰寡核苷酸	变化（20 — 200 uM）	各不相同
   叠氮化物	1.5 x（寡核苷酸浓度）	10 mM DMSO 溶液
   二甲基亚砜	50体积％	—
   抗坏血酸	0.5毫米	5 mM 水中
   铜-TBTA络合物	0.5毫米	10 mM，溶于 55 vol% DMSO

2. 将炔烃修饰的寡核苷酸或 DNA溶解在耐压小瓶中的水中。

3. 添加2M 醋酸三乙铵缓冲液（pH 7.0）至终浓度 0.2 M。

4. 添加DMSO，并涡旋。

5. 添加叠氮化物储备溶液（DMSO 中的 10 mM），并涡旋。

6. 将所需体积的 5mM 抗坏血酸储备溶液添加到混合物中，并短暂涡旋。

7. 通过向其中鼓泡惰性气体 30 秒来对溶液进行脱气。可以使用氮气、氩气或氦气。

8. 将所需量的 10 mM 铜 (II)-TBTA 库存在 55% DMSO 中添加到混合物中。用惰性气体冲洗小瓶并盖上盖子。

9. 涡旋混合物。如果观察到明显的叠氮化物沉淀，则将小瓶在 80°C 下加热 3 分钟，然后涡旋。

10. 在室温下保存过夜。

11. 用丙酮（对于寡核苷酸）或乙醇（对于 DNA）沉淀结合物。

    沉淀寡核苷酸缀合物：

    向混合物中添加至少 4 倍过量体积的 3% 高氯酸锂丙酮溶液（如果混合物体积很大，则分成几个小瓶）。

    沉淀 DNA 缀合物：

    向混合物中添加乙酸钠至终浓度0.3M；

    添加 2.5 体积的乙醇（或 0.8 体积的异丙醇）。

    充分混合并在-20°C下保持20分钟。

12. 10000 rpm 离心 10 分钟。

13. 丢弃上清液。

14. 用丙酮 (1 mL) 洗涤沉淀，以 10000 rpm 离心 10 分钟。

15. 弃去上清液，干燥沉淀，并通过 RP-HPLC 或 PAGE 纯化缀合物。

叠氮化物/炔基修饰的点击化学试剂用途和应用

点击化学这一概念最初源于对天然产物和生物合成途径的观察。它是由化学家KB Sharpless于2001年提出的合成概念。它是由2001年诺贝尔化学奖获得者、67岁的Sharpless教授提出的。

“点击化学”一般通过叠氮化物和炔烃相互作用形成共价键，具有高效、稳定、专一性高等优点，反应不受PH影响，可在常温条件下在水中进行，甚至在活细胞中。

分类

此外，所引入的点击化学试剂基团类型可分为以下类型：

1.叠氮化物修饰试剂（非荧光叠氮化物）的应用

1) AmdU（5-叠氮甲基-2'-脱氧尿苷） ——一种含有叠氮化物的核苷，可以通过细胞聚合酶掺入新生 DNA 中。然后以这种方式连接到 DNA 上的叠氮基团可以用炔烃或环炔烃进行修饰。

2)叠氮化物-PEG2-醛— 具有叠氮基和脂肪醛部分的连接体。

3)叠氮-PEG3-OH — 它是一种双功能分子，具有叠氮基团、伯醇和其间的亲水连接基团。

4) NHS 叠氮基丁酸酯— 用于肽和蛋白质的叠氮基标记的活化酯

5)生物素 PEG3 叠氮化物— 生物素叠氮化物和亲和探针可以用生物素标记以进行点击化学。

6) Chloro-PEG3-azide — 它是一种带有活性氯的异双功能连接体，用于各种亲核基团的烷基化。

7)碘-PEG3-叠氮化物——碘-PEG3-叠氮化物含有高反应活性的碘化物官能团，可以使各种以C-、O-、N-、S-为中心的亲核试剂与其他亲核试剂发生烷基化。

2.炔基修饰试剂（非荧光炔烃）的用途

1)乙炔酰肼——一种含有炔基和酰肼官能团的双官能试剂。与醛、酮反应，通过CuAAC反应，炔基与各种叠氮化物偶联。

2)炔马来酰亚胺——用于连接炔烃、官能团、蛋白质、肽和其他带有SH(硫醇)基团的分子，包括半胱氨酸残基。

3)炔烃 NHS 酯（NHS 己酸酯） — 炔烃 NHS 酯用于带有炔基的生物分子标记，用于铜催化的点击化学。

4)生物素炔——它是一种反应性亲和标记，可以通过点击化学附着到生物分子上。

5）DBCO NHS酯——偶氮苯并环辛炔（DBCO，ADIBO）试剂具有NHS酯功能，可以将环辛炔连接到各种分子上。

6) EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷） ——一种核苷，可以通过细胞酶掺入复制的 DNA 中。细胞中含有的 DNA 可以通过与荧光染料叠氮化物的点击化学反应来显色，以揭示细胞增殖情况。

7) STP己酸酯——炔基活化酯，用于修饰氨基。 STP 酯基是 NHS 酯官能团的替代品。

8) STP 戊酸酯— 一种活化酯，用于将炔烃引入肽/蛋白质中。