关于流式细胞分析的指南

流式细胞分析是一项实验室细胞分析技术。回顾流式细胞分析基本概念、免疫检测方法、流式细胞分析方案主要步骤和适当的对照有助于确保流式细胞分析的准确性。后文提供了一些有助成功开展流实验的要点。

一、什么是流式细胞分析

流式细胞分析是一种可根据细胞物理和荧光特性，鉴定和/或分选异质悬浮细胞群的强大技术。这是一种单细胞分析方法，非常适合同时获取大量细胞的单细胞水平定量信息，包括给定类型细胞数目和细胞内特定蛋白含量。

流式细胞分析的部分优势包括快速、可在研究异质细胞群时区分不同细胞亚群的差异，同时支持分析异质性细胞群的亚群。流式细胞分析常用于免疫分型和免疫肿瘤学研究，可分析血液、骨髓和其他样品类型的血液学差异。

二、流式细胞分析工作原理

流式技术依靠流体动力聚焦技术使细胞悬液样品形成一股单细胞液流，通过激光束。根据细胞对入射光线的散射情况，可每秒数千颗粒的速率，检测细胞大小和胞内复杂情况。随后即将生成的模拟数据转化为数字数据，进行定量和绘图分析。

根据流式细胞测定结果，可确定特定的细胞群和其亚群并通过细胞分选法物理分离，此时会根据细胞的荧光特性控制其电荷大小，从而实现细胞颗粒的静电偏转。如需更精细地鉴定亚群，则要使用探针。贴壁细胞和实体组织成功分离并制成单细胞悬液后，也可采用该技术进行分析。

三、传统流式细胞仪组件

关于流式细胞分析的低配置，即使是最基础的单激光流式细胞仪，一般都会配置至少同时检测4种荧光染料的滤光片。目前，单次实验中最多甚至可区分18种波长的光线。

传统流式细胞组件包括：

1.用于样品处理和细胞分选的液流系统

流动室：样品中的细胞通过流体动力学聚焦并流经激光照射区。

2.用于荧光检测的光学系统

光通过一系列镜片和滤光片。

根据大小、内部复杂成分和信号强度检测细胞。

3.用于信号处理、计算机显示和分析的电学系统

光电倍增管将光信号转换为电信号。

信号随后放大和数字化。

流式细胞分析方案主要步骤以及流式免疫检测

流式细胞分析方案主要分为4个步骤：  

• 样品制备：应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液，如采用酶溶液或钙螯合试剂。

• 封闭：通常采用抗Fc抗体稀释液悬浮细胞，防止一抗非特异性结合。

• 抗体孵育：流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分，包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。

• 数据采集：大多数流式细胞仪都配备获取和转化细胞特征信号必需的软件。用户可根据自身实验要求设定具体的软件参数。

适当的对照

除了目标细胞之外，每次进行流式细胞实验还应包含以下对照：

• 至少一份未染色样品，与试样同时进行每一步的缓冲液孵育，以优化实验的流速和电压。

• 一份适当的阴性对照样品，与试样基本相同，但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。

• 如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照，并与试样共同孵育，但仅用单色检测。

流式免疫检测

同其他免疫检测应用一样，流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大常用方法为：直接检测法和间接检测法。

直接检测法

直接检测法是一种一步染色工艺，通过一抗特异性结合目标抗原，可直接结合支持成像或其他结合状态检测的分子。探测位于细胞表面的抗原时，不建议固定细胞，否则可能导致抗体探针无法接触目标抗原。因此，在数据采集结束前保持细胞活力十分重要。如要查找直接检测法的抗体，可采用Antibody Explorer抗体搜索工具，将Search Within（搜索范围）设为“Primary Antibodies Only”（仅限一抗），application（应用）选择“flow cytometry”（流式细胞分析）。

间接检测法

间接检测法先用纯化抗体与目标抗原孵育结合，再用荧光染料标记的二抗（特异性靶向一抗宿主同型）与一抗特异性结合，形成一抗-荧光二抗复合物。采用纯化一抗搭配各种波长（或颜色）的荧光染料标记二抗（特异性针对生产一抗的宿主同型）可提升抗体库的模块化程度。

流式细胞仪参数测量原理

流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的设备。它可以快速测量、存储和显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理和生化特征参数，并可以根据预选的参数范围筛选出的细胞亚群。大多数流式细胞仪都是零分辨率仪器，只能测量细胞内的总核酸、总蛋白等指标，而无法识别和测量特定部位的核酸或蛋白量。也就是说，它的细节分辨率为零。

参数测量原理

流式细胞仪可以同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。测量是在测量区域内进行的，所谓测量区域是照射的激光束与从孔口喷出的液流束的垂直交点。当液流中心的单个细胞通过测量区域时，受到激光照射，以2π立体角向整个空间散射光。散射光的波长与入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形状、质膜和内部结构密切相关，因为这些生物参数还与细胞的光学特性有关，例如光的反射和折射。未染色的细胞具有散射光的特征，因此可以使用不同的散射光信号对未染色的活细胞进行分析和分类。当然，由于光学特性的变化，固定和染色的细胞与活细胞具有不同的散射光信号。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数有关，还与散射角、收集散射光的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用两种散射光散射方向：①前向角（即0角）散射（FSC）； ②侧向散射（SSC），又称90角散射。此时所说的角度是指激光束的照射方向与收集散射光信号的光电倍增管的轴向形成的大致角度。一般来说，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对于相同的细胞群，前向角散射光的强度随着细胞横截面积的增大而增大；对球形活细胞的实验表明，在小立体角范围内基本一致。截面积的大小呈线性；对于具有复杂形状和方向的细胞，它们可能变化很大，并应特别注意。侧向散射光的测量主要用于获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、细胞质和核膜的折射率更敏感，对细胞质中较大的颗粒也能给出敏感的反应。并且还可以对细胞质中较大的颗粒做出灵敏的反应。并且还可以对细胞质中较大的颗粒做出灵敏的反应。

实际使用时，仪器首先要测量光散射信号。当光散射分析与荧光探针结合使用时，可以识别样品中染色和未染色的细胞。光散射测量有效的用途是从异质群体中识别某些亚群体。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即细胞内部的荧光分子受光照射后未经荧光染色而发出的荧光； ②特征荧光，即荧光染料发出的荧光染料被照射后与细胞结合。荧光，其荧光强度较弱，且波长也与照射的激光不同。自发荧光信号是噪声信号，在大多数情况下会干扰特定荧光信号的分辨率和测量。在免疫细胞化学等测量中，如何提高信噪比是低结合水平荧光抗体的关键。一般来说，细胞成分中自发荧光分子（如核黄素、细胞色素等）含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞的比例越高，自发荧光越强；细胞样品中亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光的干扰，提高信噪比的主要措施有： 1、尽可能使用较亮的荧光染料； 2、选择合适的激光器和滤光光学系统； 3. 使用电子补偿电路来补偿自发荧光的背景贡献。