荧光染料的使用及亮度如何判断？

荧光染料是指吸收一定波长的光波并发射大于光吸收的另一波长的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并具有共轭双键的化合物。荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料。

荧光染料的工业应用

荧光染料常用于制备荧光染料产品，以及增白洗涤剂中的增白剂、用于指示信号的各种道路标线涂料、荧光标记服装等。

荧光染料的其他用途包括泄漏污水系统、水和工业污染物、连接系统、测量发电厂排放的液体、厕所泄漏、监控非法下水道连接、研究流量和绘制地图。此外，还用于纺织印染、一些特殊标志和军事跟踪等。

荧光染料的科研应用

由于其灵敏度高、操作方便，已逐渐取代放射性同位素作为检测标记，广泛应用于荧光免疫、荧光探针、细胞染色等领域。包括特异性DNA染色、染色体分析、细胞周期、细胞凋亡等相关检测研究。此外，许多核酸染料在多色染色系统中是非常有用的染色剂。

免疫分析

荧光标记单克隆抗体技术拓展了流式细胞术在细胞膜及细胞内各种功能抗原、肿瘤基因蛋白等领域研究的无限应用空间。荧光探针可以通过蛋白质交联剂与单克隆抗体共价结合。免疫荧光标记常用的染料有异硫氰酸荧光素、FITC、藻红蛋白等。

核酸扩增检测

核酸荧光染料对细胞核进行染色，定量测量细胞发出的荧光强度，从而测定细胞核中DNA和RNA的含量，可以分析细胞周期和细胞生长情况。有很多种荧光染料可以对细胞中的 DNA 或 RNA 进行染色。常用的DNA染料包括PI、DAPI和Hoechst 33342； RNA染料包括噻唑橙和吖啶橙。

如何判断荧光染料的亮度？

荧光染料是细胞生物学等科学研究中重要工具，而滤光立方体是荧光显微镜中的重要组成部分。那么一般荧光染料的亮度对比如何呢？

荧光染料的亮度可以用来比较不同荧光染料的荧光标记效果，用阴性和阳性细胞群的荧光信号之间的关系来表示。但阴性细胞群的荧光信号与仪器的信号强度、自发荧光、非特异性染色、电子噪声等多种因素有关。

荧光染料染色指数为阳性细胞群平均荧光强度与阴性细胞群平均荧光强度之差与阴性细胞群荧光强度标准差之比的一半。荧光染料染色系数仅与抗体克隆和质量有关，荧光团的纯度与质量、荧光修饰比例、激光线及其功率、长通和带通滤光片、靶细胞等因素有关.（您可能想购买荧光染料并获取荧光团列表）

荧光染料的染色指数与荧光染料的亮度呈正相关，即染料的亮度越高，染色系数越高。

线粒体超氧化物染料

详细介绍

产品咨询

线粒体超氧化物染料，产品编码：100-0991。品牌：STEMCELL

线粒体超氧化物染料，Mitochondrial Superoxide Dye

产品描述：

使用监测活细胞线粒体中的超氧化物产生。这种荧光染料是检测线粒体超氧化物产生以研究氧化应激的宝贵工具，并且已经过流式细胞术检测验证。活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是源自氧和氮分子的自由基。

特点：
• 激发波长：510 nm• 发射波长：580 nm

• 容易被超氧化物氧化，但不太可能被 ROS 或 RNS氧化

• 氧化产物在细胞中具有高荧光• 快速选择性地靶向线粒体

• 高信噪比
• 经验证可使用流式细胞术

进行检测选择性地靶向活细胞的线粒体。这种染料在与超氧化物ROS反应时被氧化，产生红色荧光。在没有超氧化物的情况下，没有吸收和可忽略不计的荧光。虽然很容易被超氧化物氧化，但它对其他ROS和RNS的氧化具有抵抗力。高信噪比使成为细胞呼吸等生物系统中超氧化物检测的合适试剂。

上海金畔生物科技有限公司

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染料聚集

通过吸收光，染料分子进入电子激发状态。在这种情况下，吸收的能量仅存储很短的时间，并在激发态的生命周期后再次辐射，例如荧光。

在染料溶液中，激发的染料分子（可视为点偶极子或振荡器）如果它们之间的距离足够大，则不会相互影响。因此，集合中存在的发色团的吸收和荧光不会改变。

在发色团之间的平均距离约为5-10nm处，影响仅通过振荡器的“辐射场”发生，即没有直接接触。例如，通过染料分子的模型证明了两个染料分子之间的这种相互作用。 福斯特共振能量转移 （FRET） 描述。

如果发色团之间的距离变得更小，例如在非常浓缩的溶液中，由于各个振荡器的静电力，可能会产生强烈的相互影响。由于单个染料分子的分子间相互作用，这种染料溶液的吸收和荧光行为都发生了很大变化。


罗丹明6G水中
在罗丹明6G浓水溶液的紫外/可见光谱中，可以在主吸收带的短波侧观察到肩部的外观。如果通过稀释溶液来改变浓度（c），并以相同的方式增加比色皿的层厚（d），以便根据朗伯-比尔定律始终可以期望相同的吸光度，则可以发现以下过程：



等吸点的出现 – 所有涉及物质的浓度变化是线性的，dE / dc = 0适用 – 表明两个（或多个）物种正在以定义的方式相互转化或彼此平衡。因此，这是一个动态平衡。



解离或二聚化常数可以通过实验确定：在稀释系列中，溶液的稀释总是由层厚度的变化补偿，“有效消光系数”可以通过在了解稀释因子和重量浓度的情况下（单体）最大值处测量的吸光度来计算。重量浓度由不发生二聚化的高度稀释溶液的紫外光谱确定。由于朗伯-比尔定律中的单个吸收具有相加性，因此可以用反应方程或.dem质量作用定律来表示有效吸光度或有效消光系数。 通过解离常数的参数变化和合适的图形绘制，最终得到一条直线，从其斜率和截距中可以确定单体和二聚体的消光系数。

疏水相互作用
有机染料的聚集尤其发生在具有高离子强度的水或溶剂中。主要原因是分子间范德华力：通过所谓的“疏水相互作用”，亲脂性分子试图“逃避”亲水性水分子，即为水合物壳提供尽可能小的表面积。这种现象还导致玻璃表面上的染料或基底分子上的非特异性键的吸附。

形成二聚体或更高聚集体的趋势取决于

 

由于它是动态平衡 – 如上所述 – 二聚体可以通过稀释溶液转化为单体。当测量的吸收光谱不再随着进一步稀释和层厚度的相应增加而变化时，达到“单体光谱”。适用于大多数疏水性 阿托-这是吸光度约为0.04（层厚1cm;c = 10-7 – 10-6 摩尔/升）。




蛋白质偶联物中的分子内相互作用/DOL测定
当染料NHS酯与蛋白质的氨基反应时，可以形成染料偶联物，其中共价键合的染料分子紧密相邻并且可以相互作用。这以同样的方式表现为吸收光谱的强烈变化，正如在ATTO 565阶亲和素偶联物的例子中可以清楚地看到的那样：



在共轭光谱中观察到一个额外的短波吸收带，类似于具有足够高浓度的水性染料溶液的“二聚体带”。因为在这种情况下它是 分子内 共价键合染料分子的相互作用，吸收光谱通过稀释共轭溶液而改变 不！
在这种情况下，标签程度（DOL）的确定在我们的工作规范中规定”蛋白质标记“的描述。


两种形式的聚合之间有一个基本的区别：

H 聚集体 （H = 催眠致变色）， 短波
当两个或多个染料分子以这样的方式相互连接时，就会发生这种类型的聚集，即它们的过渡偶极矩（在 S 的情况下0 – S1 过渡通常沿发色系统的纵轴运行）彼此平行。与单体吸收相反，观察到一个半致变色的吸收带。

由于空间接近，电子结构相互影响，可以说两个分子必须一起考虑。能级被分裂，量子力学现在允许的吸收跃迁更有能量，因此波长更短。从这种较高的激发状态开始，发生快速的内部转换（IC），从而使荧光被淬灭。




J 单位（根据 E.E. Jelley），长波
在这种类型的聚集中，获得吸收带的长波偏移，这与带的半宽显着减小有关。

J-聚集体通常存在于聚甲胺染料中，例如花青、亚菁或类似的发色团。Jelley和Scheibe使用染料假异氰素独立地观察了这一现象。对于由单个染料聚集形成的“超分子聚合物”的模型描述，已经提出了各种类型。对分子关系简单的描述是单个分子一个接一个地排列自己，因此过渡偶极矩也在同一条线上。对分子的共同考虑再次导致能级的分裂：量子力学允许的跃迁现在能量较低， 这解释了吸收带的长波偏移。



聚集会受到溶剂成分、盐或其他物质的添加以及浓度的强烈影响。在理想条件下，所述极窄的吸收带可以在紫外/可见光谱中找到。此外，与H聚集体相比，可以在这里观察到荧光，特别是在较低的温度下： 然而，发射带的最大值也非常窄，仅比吸收最大值长几纳米。
根据实验条件，文献中还描述了吸收带的“展宽”，除其他外，通过包含J聚集体的禁止电子转移来解释。

ATTO 488 标记的磷脂
解决方案来自 阿托 488 标记的磷脂 纯氯仿最初令人惊讶，因为它们具有意想不到的颜色：钝溶液不是带有亮绿色荧光的浅黄色，而是呈粉红色至品红色。吸收的长波偏移可以通过J-聚集体的存在来解释。当所讨论的溶液用甲醇稀释时，颜色变为通常的黄色阴影，并且可见强烈的荧光。通过改变溶剂组成，聚集体被推回。
下图显示了 阿托 488 选择 1，2-二棕榈酰基-锡-纯氯仿和氯仿/甲醇溶剂混合物中的甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE）（8：2，v/v）：

 

在左侧，两种解决方案都在正常日光下显示。在右侧，当用紫外光（366nm）照射时，可以特别清楚地看到甲醇混合溶液的绿色荧光。

荧光量子产率的测定

除了荧光的光谱位置外，荧光量子产率（η fl；英文fluorescence quantum y field，QY）是荧光团的一个重要光学参数。除了消光系数的大小，当染料用作荧光标记时，量子产率的水平特别决定了获得的信号强度：因此在英语用法中，消光系数和量子产率的乘积被称为作为荧光团的“亮度”。

量子产率本质上取决于染料的分子结构，但也受到许多外部因素的影响。这些包括环境的温度、粘度、极性和pH值。这种环境可以由溶剂分子和任何溶剂组成，也可以由例如偶联的生物分子或细胞膜组成，荧光染料位于其附近。通过改变荧光，可以得出有关环境某些特性的结论：可以说，荧光染料充当分子探针。

荧光量子产率定义为以荧光形式发射的光子数（= 光量子）与样品先前吸收的光子数之比：如果所有



吸收的光子都以荧光形式发射，则量子产率为 1 或 100 % 获得。然而，激发态的非辐射失活过程总是与发射竞争，因此部分吸收的能量以热量的形式释放到环境中。

正是这种现象被用于绝对判定通过“量热”方法（例如热开花方法）的量子产率。这需要相对复杂的测试设置以及对测量概念和评估的全面理论理解。

更简单地说，荧光团（样品）的未知量子产率可以通过将其与荧光光谱仪中标准或参考染料（参考）的已知量子产率进行比较来确定。这种所谓的相对确定可以通过不同的方式进行：

• 在单次测量中比较样品与参考染料

• 在几个单独的测量中将样品与几种参考染料进行比较

• 将样品与不同浓度的参考染料进行比较，并对获得的测量值进行后续评估。

结果的统计准确性随着进行的比较测量的次数而增加。

使用相对方法的理论先决条件是要比较的两种溶液，样品和参考，在激发波长下具有相同的吸收，因此吸收相同数量的光子。然后两种溶液在相同条件下记录的积分荧光光谱的商（IF = 荧光带的面积）给出两种染料的量子产率比，这样就可以很容易地计算出未知的量子产率：



记录样品和参考的整个荧光光谱（积分荧光强度）的重要性通过以下示例用这种比较方法进行了说明：染料



ATTO 488羧基和ATTO 430LS羧基在吸收光谱的交叉点被激发（相同的吸收) 和测量的荧光光谱。与标准品（罗丹明 6G）的比较测量导致ATTO 488羧基的荧光量子产率为 80%。使用此值，使用描述的相关方法获得ATTO 430LS的 65% 的值羧基。另一方面，如果您只查看相应荧光最大值处的强度，您只能从ATTO 488羧基的已知 80% 中获得 33% 的ATTO 430LS羧基。这种强烈的差异是由于荧光带的宽度不同，即两种染料的荧光光谱分布不同。 通过使用相同的测量参数，可以从设备端实现用于记录样品和参考荧光光谱的相同条件。这些包括光束路径的几何形状（例如 90° 或正面布置）、检测器放大（增益）、狭缝宽度（或带通）和相同的激发波长。


例如，可以选择样品和参比的长波吸收带的交点作为激发波长。然后，在染料条带的相应最大值处的吸收可能略有不同。
使用示例 阿托 488 羧基和 阿托 532 羧基在各自的吸收最大值处的吸光度值略有不同，这一点变得很清楚：在记录了两种测量溶液的吸收光谱后，可以通过叠加两种光谱来确定两种溶液具有相同吸光度（此处为0.0183）的交点（此处为513.1 nm）。（对于较小的值，吸光度和吸光度相同。



另一方面，如果决定在样品和参考的吸收最大值处激发，则两种溶液在各自波长下必须具有相同的吸收。在所示示例中，ATTO 488羧基可在 500 nm 激发，ATTO 532羧基可在 532 nm 激发；两种溶液的吸光度均为 0.0420。



在这种情况下，必须在荧光测量中对两个激发波长下的不同激发强度进行相应的校正。在现代荧光光谱仪中，这种与波长相关的强度差异由光电二极管确定为标准，同时还测量激发光源随时间的强度波动。此校正必须在测量期间通过设备软件激活，因为此后将无法再进行。

此外，所选测量范围应覆盖整个荧光光谱，即长波边缘的测量强度应几乎降至检测器噪声水平。

即使满足所有这些要求，荧光量子产率的精确测定在实践中也非常苛刻，需要做好充分的准备和仔细的测量。

 
关于量子产率测量和可能的误差来源的说明
 

• 参比染料必须合适，并且必须足够精确地知道其量子产率。例如，可以通过将其与另一个参考进行比较来确保这一点。

• 参比染料的选择方式应使其能够在与样品相同的范围内被吸收，即激发。理想情况下，两个吸收光谱重叠，并且可以在荧光测量期间在两个波段的交叉点激发。

• 必须保持所有玻璃器皿和比色皿绝对清洁。

• 使用的溶剂应具有“光谱学”规格，并应检查其固有荧光。

• 例如，如果由于溶解度的差异而将不同的溶剂用于样品和参比，则必须通过在计算中包括两个折射率n来考虑这一点：

• 对于荧光测量，应使用光程长度为 10 mm 的标准荧光比色皿。

• 为了减少重吸收效应的发生，10mm电池中的吸光度不应超过0.05。
  在较高浓度下，可能会发生所谓的内部滤光片效应，这极大地伪造了荧光测量：
  一方面，激发光不再深入溶液，这可能导致比色皿中心的样品激发减少。
  另一方面，从那里发出的荧光在离开比色皿之前通过溶液时被光束路径中的其他荧光团部分（重新）吸收。这导致荧光光谱在短波范围内被切断。

• 必须注意确保吸收测量的基线不会因未溶解颗粒或脏比色皿窗口的光散射而失真。

• 顺便说一下，这种散射现象也会干扰荧光测量，因为散射光可以到达溶液中颗粒或比色皿表面上的检测器。因此，在测量前应μ过滤所使用的溶剂和溶液，并用不起毛的布从外部擦拭比色皿窗口。注意：指纹！

• 荧光测量的测量参数（增益、狭缝宽度）必须适应发生的荧光强度，以便所使用的检测器（例如光电倍增管）不会因过多的光而损坏。测量必须在探测器的线性范围内进行，因为只有这样，测量的光强度才会与照射的光强度成正比。

• 人们应该意识到温度对测量结果的影响。

 
许多制造商现在都包含使用其荧光光谱仪测量荧光量子产率的精确说明和工作说明，也可以从相应网站下载。通常也可以在这里找到有关相应设备设置和测量参数的详细信息和注意事项。正在努力开发荧光标准的方法和程序。我们给出的荧光光谱是用HORIBA Jobin Yvon的

Fluorolog 3荧光光谱仪测得的。为此，ATTO-染料在 22°C 下检查水溶液（PBS，pH 7.4）中的相应羧基衍生物。测量是在标准的 90° 排列中进行的，具有水平的激发和发射极化。为了确定ATTO染料的荧光量子产率，将具有荧光量子产率的荧光团用作参考染料。取决于光谱范围，例如B、使用罗丹明6G、罗丹明630等。

荧光光谱的一般信息

在吸收光谱仪的情况下，几乎只使用双光束装置，其中样品溶液和参比物质（例如带有纯溶剂的比色皿）“同时”扫描。结果，获得的频谱成为所谓的 设备特性 这是由于单色器（光栅、狭缝）和镜子反射的不同透射率，除其他外，对于不同的偏振光和特定的检测器特性。

由于荧光光谱中原则上不存在这种参考光束路径，因此必须以不同的方式校正每个荧光光谱仪的器件特性，具体取决于光学元件和光束路径的路径，这些特性是不同的，以获得样品的“真实”荧光光谱。

在现代荧光光谱仪的情况下，控制和评估软件通常包含所谓的 校正功能，可用于在测量过程中直接或通过用户的后续指令校正被测设备光谱。此校正功能由制造商创建，例如，通过将相关设备测量的发射光谱与校准灯的实际发射光谱进行比较。

除此之外，在每次荧光测量中都应考虑另一种现象。这些是 荧光偏振： 只有当荧光团在激发态的生命周期内能在培养基中自由移动时，才能获得非偏振荧光。在这种情况下，水平和垂直偏振荧光的比例是相同的。

自由迁移率受溶剂的温度相关粘度和分子体积的影响。

在丙酮、甲醇、乙醇和水等低粘度溶剂中，这种极化效应通常只在室温测量中寿命在纳秒范围内的小型有机荧光团中起次要作用。

但是，如果样品和/或参比的荧光由于分子尺寸和/或荧光寿命的强烈不同而不再非偏振甚至不同的偏振，则可能导致测量的荧光光谱伪造，从而导致错误计算的量子产率。

为了确定荧光基团溶液的荧光偏振，有一种相对简单的方法，可以在J. R. Lakowicz中找到其理论推导和解释。

研究与大分子（聚合物、蛋白质、DNA等）偶联的荧光标记物的荧光偏振，其自由迁移率在其激发态的生命周期内受到限制甚至受到抑制，可以与FRET技术相结合，为分子结构（几何形状，距离，方向）和相关动态现象提供重要的见解。