慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中,由于加入了GFP标记蛋白,因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便,且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解,然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下慢病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液,定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据。检测灵敏,可以从100ul慢病毒上清中检测出1010VP/ml的慢病毒,足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit VPK-112 荧光法检测,20次分析

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择;多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案;ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒,解决了慢病毒低滴度的软肋;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

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AAV核酸滴度定量检测知多少

随着基因治疗技术日趋完善和临床经验不断积累,监管机构对基因治疗产品的质量控制也愈发严谨慎微。准确的滴度检测是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分,也是开展临床研究的前提条件,AAV基因治疗临床试验检测方法汇总如下表。

检测项目

检测方法

一般理化指标

外观

直接检测法

pH

电位滴定法

渗透压

渗透压测定法

纯度

蛋白含量

SDS-PAGE/银染

病毒颗粒聚集体

动态光散射

空壳率

透射电镜

OD260/OD280

分光光度计法

宿主DNA残留

qPCR

质粒DNA残留

qPCR

HKE293/BSA

ELISA

核酸酶

ELISA

性能

核酸滴度

qPCR

转染效率/感染滴度

TCID50

基因表达

ELISA

体外活性

安全性

内毒素

凝胶限度试验法

无菌

培养法

复制型AAV

培养法

其中核酸滴度检测是以AAV衣壳中所含基因组作为定量依据,测定的是含有目标基因组的AAV浓度。AAV中包含的基因组是其表达蛋白或RNA的前提,是AAV药物发挥药效的核心和基础。目前AAV核酸滴度检测方法有点杂交法、分光光度计法和qPCR法,qPCR作为第二代PCR方法,是各大研究机构和药企最广泛采用的定量方法。然而qPCR技术存在较大局限性,如检测结果只是相对标准曲线的“相对”定量,且反应容易受qPCR体系中酶或蛋白等成分的干扰,定量结果不够精准等。

ddPCR方法 vs qPCR方法

  • 数字PCR(ddPCR)被称为第三代PCR技术,与qPCR技术相比具有以下显著优势:
  • ddPCR无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量;
  • ddPCR有更高的准确度,定量CV值通常小于10%;
  • dPCR抗干扰能力更优,有实验显示,ddPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术[1]

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qPCR方法与数字PCR方法优劣势比较

另一组测试数据也显示[2],优化后的qPCR方法中位CV分别为5.35%和4.37%,较大值分别为33.2%和8.7%,而数字PCR用三个独立引物探针组的中位CV值为2%或更低,且分布更密集,可见数字PCR方法定量更加准确,重复性更高。

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从监管趋势来看,美国药典在细胞和基因治疗标准品章节中明确写道,AAV标准品定量将会使用数字PCR进行定量,可见数字PCR方法在细胞和基因治疗领域中绝对定量的突出优势。

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达普生物AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒邀请广大客户进行内部测试

综上所述,在以AAV为递送载体的基因治疗产品的定量检测中,ddPCR技术已受到越来越多业内人士的青睐,为了满足广大客户的需求,达普生物即将推出其自主研发的AAV基因组ddPCR精准定量试剂盒。上海金畔生物科技有限公司作为达普生物中国一级代理商,现携手达普生物开展“AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试活动”。

报名方法:即日起至2022年6月15日,关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号”(微信号:www.jinpanbio.cn),发送关键词“AAV定量”,填写表单,即可获得免费检测机会。每个客户限测5个样本,名额有限,先到先得!

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上海金畔生物科技有限公司作为专业服务中国生命科学领域16年的供应商,以专业和优质的服务赢得了众多客户的支持和信赖!目前已成为多家世界知名跨国企业中国区研发和生产基地、制药企业与诊断企业以及各大高校与科研院所官方采购平台的指定供应商。其中上海金畔生物科技有限公司一级代理商的达普生物科技有限公司,拥有多个自主研发的仪器平台、全球领先的生物芯片工厂和试剂体系。可广泛应用于病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选和癌症早期筛查等多个领域。

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达普生物科技有限公司由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心,拥有微流控芯片、仪器及试剂 GMP 厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域,致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产的两大技术平台:数字 PCR 系统和单细胞组学系统。产品适合应用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。

参考文献:

  1. Dobnik, David, et al.2019:1570.,Dobnik, David, et al. “Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.” Frontiers in microbiology (2019): 1570.
  2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)

内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响


内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响



基因疗法正在彻底改变我们治疗人类疾病的方式。任何通过修改个人基因来治疗或治愈疾病的技术都被认为是基因疗法的形式之一。这些技术可以通过几种潜在的机理实现。一个基因的致病之处可能被灭活,或被健康的版本所取代,又或者是引进一个新的基因来对抗一种疾病。基因治疗产品是通过将遗传物质引入细胞核而发挥作用的。为了引入遗传物质,科学家需要一个可将基因、核酸酶或短发夹RNA(shRNA)运送到人体细胞核的运输系统。携带这种遗传物质的运输工具被称为载体1

应用于基因治疗的载体多种多样,可分为病毒型和非病毒型。病毒载体是目前美国食品和药物管理局(FDA)批准的基因疗法中使用的载体,而非病毒技术作为一种安全有效地将遗传物质运送给细胞以达到治疗效果的方法正在研究当中1。但与非病毒载体相比,病毒载体的基因转移效率高10倍至1000倍。然而我们应该意识到,基于非病毒载体的基因疗法安全水平高且生产成本低,具有非常高的吸引力,在未来的药物开发中具有很大的潜力5


目前最常见的两种载体是质粒和病毒。质粒是细胞内的一种小型染色体外DNA分子,与染色体DNA物理分离,可以独立复制。最常以小型环状双链DNA分子的形式出现在细菌中,但有时也会出现在古细菌和真核生物中。在自然界中发现的质粒,往往携带着有利于生物体生存的基因,并能提供独特的优势,例如对抗生素的强烈抗性。染色体很大,并且含有在“正常条件“下生活的全部基本遗传信息,而质粒通常很小,只含有在某些压力、逆境或疾病状态下才可能发挥作用的额外基因2。另一方面,由病毒载体包装的基因可以整合到宿主细胞的基因组中并永久表达。一些类型的病毒可将其基因组插入宿主的细胞质中,但实际上并没有进入细胞,而另一些病毒会伪装成可穿透细胞膜的蛋白分子,进而很容易地进入细胞。可能发生的病毒性感染主要有两种类型,一种被称为裂解性感染,另一种为溶源性感染。裂解循环的病毒在插入其DNA后不久就迅速产生更多的病毒,随后从细胞中迸发出来,继续感染越来越多的细胞。溶源性病毒则是将其DNA整合至宿主细胞的DNA后,在对某个触发因素作出反应前可在体内存活多年。病毒会像细胞一样繁殖,并且不会对所依赖的宿主造成任何伤害,直至被某种方式触发。一旦被触发,病毒就会从宿主的DNA中释放出来,以此创造新的病毒3


最早应用于基因治疗的病毒载体是以腺病毒为基础的,腺病毒会引起普通感冒以及人类呼吸道、肠道和眼部感染1。腺病毒以双链DNA的形式携带遗传物质。当进入宿主细胞时,这种遗传物质可短暂存在于细胞核中,因此能够像其他基因一样自由进行转录。并且,人们发现腺病毒会在患者体内引发强烈的、具有潜在危险的免疫反应,因此,使用该类型病毒进行基因治疗的研究仍在继续3。逆转录病毒、单纯疱疹病毒等其他病毒载体也已被使用。


基因治疗产品与所有人体治疗药物一样,关键在于不受内毒素污染。内毒素,也被称为脂多糖(lipopolysaccharide)或LPS,是革兰氏阴性细菌外细胞膜的一种成分。作为一种极强的热原,微量接触也会导致危险的发烧甚至败血症。此外,内毒素具有高度的耐热性,很难通过传统的方法来清除。


根据FDA管理指南,所有静脉注射药品的内毒素含量必须低于5 EU每公斤体重。但内毒素普遍存在于环境,实验室也不例外,因此,基因治疗产品在用于人体测试前进行内毒素污染测试是至关重要的。


2019年发表于《Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 》的一篇论文测试了一种从重组腺相关病毒(rAAV,一种常见的基因治疗载体)原液中去除内毒素污染的新方法。大肠杆菌通常是内毒素污染的来源,rAAV便是由大肠杆菌中分离出来的质粒DNA制备而来。8


该作者使用LAL(美洲鲎试剂)检测法来定量内毒素水平。清除rAAV原液的挑战之一是任何残留的洗涤剂都会引起毒性,还会干扰LAL检测试剂,从而导致假阴性。其原因在于掩蔽效应,即脂多糖分子被洗涤剂分子包围,无法与LAL试剂相互作用。因此,作者将洗净原液中的洗涤剂水平保持在临界值以下,以便于使用LAL精准地检测内毒素。8


这项研究强调了彻底净化基因治疗产品的重要性,以及为了去除残留的洗涤剂而进行严格的交换缓冲液冲洗的必要性。随着基因治疗的普及,科学家们仍须意识到内毒素污染潜在危险的重要性,以及需要避免由于洗涤剂残留而造成假阴性结果。8


内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

与基于基因疗法的治疗方法一样,细胞治疗产品也需要考虑可能受到污染的问题。细胞治疗产品包括细胞免疫疗法、癌症疫苗和应用于某些治疗适应症的其他类型自体或异体细胞,如造血干细胞和成人及胚胎干细胞。基因治疗是通过蛋白载体或载体将遗传物质转移到合适的细胞中,而细胞治疗是将具有相关和必要功能的细胞转移到患者体内。4,6


 在实验室环境中培养任何一种类型的细胞时,所面临的首要问题始终是避免污染。生物污染往往是工作的重点,同时也是最容易检测和避免的。


例如,大多数细菌或真菌污染在细胞培养基中肉眼可见,并可以使用抗生素处理来预防。而支原体或其他细胞系等其他生物污染物则更难检出,但仍可通过市面上的检测试剂盒进行检测。


 化学污染与生物污染相比,受到的关注相对较少,并且更难检测和避免。其中,最隐蔽的化学污染物就是内毒素。潜在的内毒素污染源包括水、细胞培养基、血清、玻璃制品和塑料制品。正如本文在基因治疗产品部分中所提及,细胞治疗中发现的内毒素对高压灭菌和辐照都有很强的耐受力,这意味着它们可以在没有活细菌的情况下存在。其高疏水性也使其对塑料制品具有很强的亲和力,而且内毒素与活细菌不同,在细胞培养基无法通过肉眼确认。此外,内毒素不能用抗生素去除,需要使用专门的内毒素清除溶液。


采取措施避免内毒素引起的细胞培养问题,可以使研究人员对实验结果更有信心。为了帮助保持细胞培养物及其产生的疗法不受内毒素的污染,人们已提出了多种解决方法。其中,包括使用高纯度的水和低内毒素的FBS,以及使用经认证为无内毒素的塑料器皿。7 然而,除了使用纯化的原材料和试剂外,建立强大的无菌技术和灭菌程序,对减少内毒素污染的几率而言也非常重要。


无菌技术是每一位生物研究人员必备的核心技能之一。为避免出现实验伪像和潜在的细胞死亡,有必要防止细胞培养物的污染。此外,动物研究中的污染也可能导致感染或死亡。


大多数生物污染物可以使用漂白剂或乙醇等标准的消毒试剂来避免,但内毒素高度稳定,在没有活菌的情况下也能继续存在。因此,对于质控技术人员来说,保持严格的无菌技术标准操作程序至关重要。


定期更换手套是内毒素相关无菌技术的示例之一。没有经验的细胞培养技术员可能认为经常用乙醇喷洒手套就足以保持无菌状态,但乙醇可能会带来内毒素污染,因此,应为使用者制定更换手套的频率标准。


内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

内毒素污染会极大地影响体外实验,特别是涉及免疫细胞的实验。巨噬细胞对内毒素的反应表现为IL-6分泌增加,而T细胞的表现为增殖和淋巴因子的产生增加。


受到内毒素的影响,非免疫细胞也可能会失调。传统上认为内毒素是通过CD14受体起作用的,但缺乏这种受体的细胞仍可对内毒素污染表现出强烈的反应。例如,一项研究报告指出,心肌细胞在暴露于内毒素时,会出现收缩功能障碍。其他研究也报告了CHO细胞内蛋白产生的改变以及输尿管上皮细胞中克隆效率的改变。


此外,不同的细胞系对内毒素污染的灵敏程度差异巨大。一些细胞系在内毒素低于1 ng/mL的情况下即表现失调,而其他细胞系则需要高达5000 ng/mL的浓度。也有理论认为,在培养中生长多年的细胞系(如HeLa和CHO细胞)可能随着时间的推移被自然选择为耐内毒素。基于这一点,很难确定一个广泛适用的内毒素污染安全阈值。


进行细胞培养时,购买低含量内毒素产品是至关重要的。然而,内毒素污染可能在打开试剂后产生,或在玻璃器皿/塑料器皿中转移污染,因此定期进行内毒素检测显得十分重要。


对于基因治疗和细胞治疗产品来说,鲎试剂(LAL)检测法为量化内毒素水平提供了一个兼具成本效益和高灵敏度的选择。本检测法依赖于从鲎血液中提取的蛋白,这些蛋白在内毒素存在的情况下发生凝结反应,可以对其定量以获取高度准确的内毒素水平读数。在维护我们的基因和细胞治疗的安全性方面,特别是应用于大规模生产以及重要的体外实验时,这种检测方法将会继续发挥关键作用。



◆相关产品

点击此处查看相关产品:内毒素检测系统Toxinometer® ET-7000

点击此处查看相关产品:PYROSTAR™ ES-F 系列鲎试剂

◆参考文献


1. 

‘How Does Gene Therapy Work?’ (2020 June). Genehome. Available at URL: https://www. thegenehome.com/how-does-gene-therapywork/vectors?gclid=Cj߿KCQjwkZiFBhD9ARIsA GxFX8C5ࠂpUEumd-W8ࠁHmYSL_5gBGNPtMMD rR_882PILGN_0n9vF8icjPboaAjA-EALw_wcB

 

2. 

‘Plasmid’. (2021 May 6). Wikipedia. Available at https://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid

 

3.

‘Vectors in Gene Therapy’. (2020 December 16). Wikipedia. Available at URL: https:// en.wikipedia.org/wiki/Vectors_in_gene_ therapy


4.

‘Cellular and Gene Therapy Products’. (2021 March 2). U.S. Food and Drug Administration. Available at URL:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-genetherapy-products#:~:text=Cellular%20therapy%20products%20include%20cellular,adult%20and%20embryonic%20 stem%20cells 

5.

 Lundstrom, K. (2019). “Gene Therapy Today and Tomorrow”. National Center for Biotechnology Information, ‘Diseases’. Published online 2019 April 28. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC6631424/


6.

David, A., Professor. “How Cell Therapy differs from Gene Therapy”. Future Learn. Available at URL: https://www.futurelearn. com/info/courses/making-babies/0/ steps/23934#:~:text=Whereas%20gene%20 therapy%20involves%20the,appropriate%20 cells%20of%20the%20body.

 

7.

Easthope, E. (2020). “Five Easy Ways to Keep Your Cell Cultures Endotoxin-Free”. Biocompare, published online 2020 April 20. Available at URL: https://www.biocompare. com/Bench-Tips/563017-Five-Easy-Ways-toKeep-Your-Cell-Cultures-Endotoxin-Free/


8.

‘Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol’. (2019 December 13). Molecular TherapyMethods & Clinical Development, published online 2019 September 6. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC6804492/

 内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响  Lisa Komski

Lisa Komski是FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation LAL部门的销售总经理。在化学和生命科学行业拥有近30年的职业生涯,是美国食品和药物管理局(FDA)要求和cGMP方面的业务发展专业人士。Lisa拥有生物学和医学技术学位。


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