细胞复苏时血清更换注意事项及步骤

血清更换注意事项及步骤

一、推荐在复苏时步骤：

1.首先准备一只15ml离心管，加入3倍以上体积培养基（含10%澳范血清，1%青链霉素的适配培养基，具体培养基类型查询ATCC）。

2.将需要复苏的冻存管放于37℃水浴锅中（液面没过冻存液），并持续轻柔晃动冻存管，直至冰晶消失。

2.迅速转移细胞至无菌操作台，酒精棉球擦拭干净冻存管表面后开盖。

3.轻柔地将细胞转移至已经准备好的无菌离心管，800-1000g离心5min（不同离心机离心力不同，请选择合适离心力），弃去上清，用上述培养基重悬细胞，放入37℃，5%二氧化碳培养箱培养。并隔天更换培养基。

二、对于对数生长期的细胞，推荐按梯度更换血清：

         将上述培养基与之前所使用培养基按1：1混匀后，采用换液法更换培养基。持续培养1代后更换为只含10%澳范血清的培养基。（其余所需物质照常添加）

三、不推荐直接更换血清：

        可能导致细胞营养不良，形态变皱缩/纤细，代谢和活性相关表型改变。

血清储存及化冻

储存：在 -15°C到-20°C低温冰箱血清的保存期限为5年。

解冻：第一步：从-40°C–80°C超低温冰箱取出后需在 -20°C冰箱平衡48小时。

           第二步：立放与水平摇床并开启摇床。若解冻血清的时候无法使用摇床则在室温下融化，前半小时内每隔5分钟-10分钟轻微晃动血清使其瓶底及瓶身周边的纤粘蛋白融化。

4度冰箱解冻血清容易造成析出并丢失贴壁因子、会影响细胞的培养。

解析：血清中含有冷不溶蛋白较多如血清中纤粘蛋白（fibronection）属于冷不溶蛋白，在4度解冻时，不会溶解，是以沉淀状态在血清中。

           冰箱存在自动化霜功能，冰箱在化霜过程中箱体处于加热状态、贴近箱体底部及周边储存的试剂容易被溶解反复冻融影响质量。实验室使用化霜冰箱的时候存放试剂时需避免直接存放在锡箔纸上面。

传代方法的概述

传代方法概述

1.消化传代：

        弃去培养基，PBS润洗一次后加入适量胰酶晃匀（以盖住细胞表面为宜），放入培养箱消化。细胞呈斑片状时加入等体积新鲜全培养基终止消化。吹打细胞后转移悬液至洁净离心管，600g离心5分钟。弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞至培养瓶，补足培养液体积，移入培养箱培养。

2.直接传代：

         用吸管吸取细胞悬液的1/2～1/4至另一瓶中；加入适量的新鲜培养基，补足培养液体积，培养箱继续培养。

3.离心传代：

         将细胞悬液转移至离心管内，600 g 离心 5 min，弃去上清。使用新鲜的培养基重悬细胞至新的培养瓶，补足培养液体积，培养箱继续培养。

细胞冻存注意事项

细胞冻存步骤：

使用上述传代步骤至离心后，弃去培养基，用600μL~1mL冻存液重悬细胞后，转移细胞至冻存管。

无血清冻存液可直接冻于-80，否则采取梯度降温法冻存。

含血清冻存液成分：20％FBS、10％DMSO、70％1640培养液

细胞冻存需注意：

● 细胞数量过少可能导致复苏困难，应至少有5*105。

● 冻存时应处于对数生长期，状态不佳的细胞复苏困难。

● 尽量采用梯度降温并使用梯度降温盒。

● 冻存的细胞不可直接移入液氮，应-80冻存超过6小时后再液氮冻存。

● 冻存和复苏的时间间隔不宜过短，不可小于三天。

如何选择合适的培养基？

选择适当的细胞培养基是细胞培养中非常重要的步骤，它会影响细胞的生长速率、状态和实验结果。

1.首先参考文献和厂家建议：

        查阅ATCC（American Type Culture Collection）或相关文献，了解以前研究同一或相似细胞系的人所使用的培养基和条件。细胞及细胞培养物厂商提供的说明都是有用的参考资料。

2.根据细胞类型和实验需求：

        常规来说，培养基均需要添加10-15%血清（一般为胎牛血清）以提供蛋白，部分生长因子，维生素及其他辅助物质。以促进细胞生长、维持表型。非无菌室的细胞房应常规添加抗生素。

        某些细胞可能需要特殊培养条件，以满足其特殊的要求。如原代B细胞需要添加LPS以激活，神经细胞培养常需添加B-27等。

        也可基于实验改变培养条件，如转染细胞或细胞同步化时常使用减血清培养基opti-MEM。

3.进行试验性培养：

       采用此类培养或更换培养条件时（如换血清），建议进行试验性培养，以确定所选培养组分是否适用于您的细胞。

让我们帮助您选择胎牛血清

0501金牌胎牛——推荐用于原代胚胎干细胞、iPSC、T细胞、B细胞等

0502特级胎牛——推荐用于原代成纤维、巨噬细胞、T细胞等

0503优级胎牛——推荐用于常见细胞系、肿瘤细胞，工具细胞等

尽管胎牛血清在细胞培养中有许多重要作用，但也需注意一些潜在的问题。例如，由于血清的来源和制备过程，可能存在批次间差异，导致实验结果难以重复/产物不稳定。澳范拥有稳定的血源和产能，尽量避免了批次效应的产生。

细胞培养进阶–原代细胞系培养是细胞培养中最常规的环节，而细胞从来源又可分为细胞系和原代细胞。从培养系统又可分为常规培养及3D/基质培养系统。不同组织来源细胞所需培养体系差别较大。

目前可提供的原代培养技术支持（维持培养与接种部分有不同）：

黑素细胞生长培养基概括

黑素细胞生长培养基——用于培养幼年人类黑素细胞的细胞培养基。配方含有佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯

PromoCell 黑素细胞生长培养基是一种含有 PMA（肉豆蔻酸佛波酯醋酸酯）的培养基，专为幼年黑素细胞的体外培养而开发。由于 PMA 是一种促进肿瘤有丝分裂的原，它可能会干扰一些实验方法。在这些情况下，我们建议使用不含 PMA 的黑素细胞生长培养基 M3。

尽管所有 PromoCell 培养基都针对原代人类细胞进行了优化，但我们收到了客户的反馈，即这种特殊培养基也可用于马、猪、鼠和大鼠黑素细胞。

成分：

• 生长培养基（即用型）：包括基础培养基和 SupplementMix

• 生长培养基套件：包括基础培养基和补充包

• SupplementMix：包含预混合在一瓶中的所有培养基补充剂

• 补充包：包含所有培养基补充品作为单独的小瓶

黑素细胞生长培养基的补充剂不含血清，而基础培养基则含有 0.2% 血清。