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【技术文章】作为化妆品原料的干细胞培养基 · 外泌体

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【技术文章】作为化妆品原料的干细胞培养基 · 外泌体

【技术文章】作为化妆品原料的干细胞培养基 · 外泌体

Anti-Ageing Co.,ltd 材料业务部 藤田英人

您是否了解市售的化妆品中含有添加了干细胞培养基和外泌体的产品？调查显示，超过50%普通消费者对人干细胞培养基作为化妆品原料有一定认知。

作为一家原料供应商，本公司销售作为化妆品原料的人干细胞培养基。2012年，在日本首次注册人干细胞培养基为化妆品原料，并开始售卖。2019年，开始正式推广外泌体。2020年，开始供应外包装粘贴了外泌体标签的化妆品原料，2022年收到了大量的询盘，该年也正好是人干细胞培养基作为化妆品原料引入日本的10周年。

◆作为化妆品的起点

人干细胞培养基充当化妆品原料的起点是韩国。众所周知，直至21世纪初，韩国都是脂肪来源干细胞研究的先行者。除研究外，其商业化的发展也如火如荼，还建立了干细胞库等，此类项目的商业用途之一就是人干细胞培养基的化妆品。由于人干细胞培养基的功能性成分、EGF和FGF等的生长因子无法仅靠涂抹渗透皮肤，所以最初是使用微针滚轮这种含有细针的滚轮在皮肤上打开微孔，并涂抹人干细胞培养基。后来，通过将其脂质体化，并添加至美容液与面霜等普通化妆品中，并于这一时期引入日本。

人干细胞培养基化妆品市场，集中在韩国、日本和美国部分地区。包括干细胞的来源在内，市场中的各类差异化层出不穷。现在在日本国内，除了人脂肪来源干细胞以外，还有牙髓、骨髓、脐带、脐带血来源的干细胞培养基作为化妆品原料出售。其中，本公司使用供应稳定且来源正规的可商用脂肪来源干细胞生产原料。

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图1. 人干细胞培养基RemyStem的生产工序

在这样的市场差异化下，目前最备受关注的产品是外泌体。本公司最初为实现差异化推广外泌体时，网络上向公众传播外泌体信息的网站只有NHK。为此，本公司的原料供应商韩国RemyBio公司快速开通了日语的外泌体专业网站（https://www.exosomes.jp），同时公开外泌体能够减少成纤维细胞的老化标记——SAβGAL等可使老化成纤维细胞再生的实验结果。因此，在化妆品行业中人干细胞培养基中存在的外泌体成分引起极大的关注。

◆外泌体化妆品的发展

最初，外泌体只是作为人干细胞培养基原料中的差异化因素之一。而现在，本公司还提供外泌体与干细胞培养基的脂质体混合制成的混合外泌体化妆品原料。外泌体也逐渐从人干细胞培养基成分之一，发展为外泌体化妆品品类。

本公司在推广外泌体的初期，曾以干细胞培养基中的外泌体含量比平均值更高作为卖点。而现在，可以将其毫无损失地用于化妆品也是重要的宣传内容。众所周知，外泌体会粘附于玻璃与塑料容器，导致产量降低。化妆品原料也相同，所以为了降低损耗，开发了抑制外泌体吸附于容器的技术EXO-SAVE。依靠该技术，本公司原料中的外泌体含量增加了约7倍（图2）。

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图2. 使用EXO-SAVE时的外泌体CD63信号分析

◆外泌体化妆品的问题与未来

人干细胞培养基作为化妆品原料的标签名称（原料的正式名称）众多，本公司命名为“人干细胞驯化培养液”。该名称的定义为“本产品是人干细胞培养几天后，从培养物中提取的培养液。初始培养基使用Dulbecco's Modified Eagle Medium，无论是否含牛胚胎血清”。普通化妆品原料，其标签名称均根据结构式和分子量进行定义，但由于人干细胞培养基是在培养基中培养干细胞数天后，去除干细胞残留的培养液。因其成分模糊，所以即使是使用相同标签名称的化妆品原料，来自不同供应商的人干细胞培养基的成分也会有所差异。

因此，外泌体的标签名为“人脂肪来源间充质细胞外泌体”。其定义是“本产品为人脂肪来源间充质干细胞在驯化培养液中分泌的囊泡”。从定义来看，可能会误以为原料仅由外泌体组成，但实际上本品还包含初始培养基的成分和水分等，具体的外泌体尺寸、数量、浓度（%）并没有规定。不仅如此，外泌体内含的miRNA和功能也没有提及。异质性虽然是外泌体作为药物发展的争议问题之一，但该现状持续存在于化妆品市场的情况下，外泌体仍可作为化妆品原料进行供应。

与药物不同，这种宽松的政策让外泌体可作为化妆品原料开始供应。但是，作为提供人干细胞培养基的优质企业，我们并不能因此而松懈，要正确地检测外泌体，并尽可能验证其对皮肤的渗透性和功能性，提供正确信息的同时，也要提供优质的原料。

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Neidhardt MOPS 最小培养基概述

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Neidhardt MOPS 最小培养基概述

NEIDHARDT MOPS MINIMAL MEDIUM是一种丰富的成分确定培养基，可实现可重复的高生长速率。

Neidhardt MOPS 基本培养基支持大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和其他类型肠杆菌的生长，其生长速度和产量与传统培养基（如复合 LB 培养基和成分确定的 M9 培养基）相当。

ForMedium Ltd 提供的 Neidhardt 培养基与 Neidhardt 等人定义的培养基略有不同。 Blattner 等人进行了修改。

Neidhardt MOPS 最小培养基是一种丰富的成分确定培养基，可实现可重复的高生长速率。

所有成分的浓度均已确定并且可以独立增加。我们还可以提供定制的 Neidhardt MOPS 基本培养基，其中某些成分的浓度发生变化。

Neidhardt MOPS 基本培养基的成分

  • 所有微量营养素（例如铜、锰等）的水平均设定为生长饱和的水平，但也足够低以确保不存在生长抑制的可能性。

  • 磷酸盐、硫酸盐、氮等常量元素的含量足够低，足以进行同位素标记。

  • 镁离子和钙离子的浓度均适合支持外膜稳定性，因为大肠杆菌需要大量 Mg2+ 和 Ca2+ 来桥接其外膜中带高负电荷的 LPS 分子。

  • 缓冲能力由吗啉代丙烷磺酸 MOPS（pKa 7.2）提供。

  • MOPS 是 GOOD 缓冲液系列的一员，具有出色的缓冲能力，且对生长没有任何明显的抑制作用。

  • 在 Neidhardt MOPS 基本培养基中，葡萄糖被用作碳源。 Neidhardt 基础盐混合物与 Neidhardt 补充剂混合物结合使用，以含 2 g/l 葡萄糖的基础盐混合物和含 20 g/l 葡萄糖的基础盐混合物形式提供。

  • Neidhardt MOPS 最小是通过将 Neidhardt 基础盐混合物和 Neidhardt 补充剂混合物混合在一起制备的。

Neidhardt 基础盐混合物包含所有微量盐和大量盐、缓冲液和葡萄糖。 Neidhardt 补充剂混合物含有所有氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶：
Neidhardt 基础盐混合物；含有所有微量和大量盐、缓冲液和葡萄糖。
Neidhardt 补充混合物；含有所有氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶。

VitroGel 水凝胶如何进行凝胶化？

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VitroGel 水凝胶如何进行凝胶化？

在室温下自信地工作。 VitroGel 水凝胶聚合不依赖于温度，也不需要交联剂。

第一阶段：
 
VitroGel 溶液在室温下稳定且自由流动。通过将 VitroGel 溶液与细胞培养基混合来开始水凝胶的凝胶化/形成。水凝胶分子与细胞培养基中的离子分子（例如 Ca2+ 和 Na+）相互作用，形成基质结构（水凝胶）。
 
当使用少量离子分子时，水凝胶形成过程很慢。此阶段的水凝胶是柔软的，具有剪切稀化和快速恢复的机械性能，这使得水凝胶易于转移到培养板或用于注射。


第二阶段：

 
软水凝胶形成后，在水凝胶顶部添加额外的细胞培养基将使更多离子分子渗透到水凝胶基质中并进一步使水凝胶交联饱和。在此过程中会形成固体水凝胶。

细胞培养的最佳营养物质和生长因子是什么？

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细胞培养的最佳营养物质和生长因子是什么？

哪种营养素/生长因子更适合我的细胞培养？

细胞培养是一种不断发展的实践，对再生医学产生巨大影响。细胞培养过程依赖于对影响培养结果的培养条件的精确调整。每种细胞类型都需要一组特定的信号才能有效生长。此外，所有细胞类型都需要基本营养物质和培养基成分。因此，一些培养基成分是通用的，而另一些则根据细胞类型而特定。

维持细胞增殖的通用培养基成分

这是维持细胞增殖的通用培养基成分列表。

  • 能量：来自碳水化合物或糖，是维持细胞新陈代谢所必需的。

  • 必需金属和矿物质：例如钙、镁、铁和其他微量金属是调节代谢途径和细胞过程所必需的。

  • 缓冲剂：磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐维持 pH 水平，中和代谢活动产生的酸化。

  • 营养素：由维持细胞途径和信号传导所需的蛋白质（或其组成部分：肽和氨基酸）或生长因子组成。培养基的这种成分根据细胞类型而变化，并且可以根据特定需要进行定制。下面概述了一些主要细胞类型及其所需营养的详细信息。

培养基还可能含有其他成分，例如 pH 变化指示剂、选择性抗菌剂和促进细胞培养实践的胶凝剂。虽然这些培养基成分不直接影响细胞增殖，但会影响细胞培养性能。

诱导多能干细胞 (iPSC) 和成纤维细胞生长因子 2 (FGF2)

多能干细胞

多能干细胞可以自我更新，并且可以分化成几乎任何其他细胞类型，包括神经元、心血管细胞、肝细胞、上皮细胞等。iPSC是一种特定的干细胞类型，是通过将体细胞重编程为多能干细胞状态而产生的。生长因子影响 iPSC 的增殖或分化行为。 FGF2 发出 iPSC 作为未分化细胞增殖的信号。

FGF生长因子

FGF2调节丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)/细胞外信号调节激酶 (ERK) 通路 [ 2 ]，这些通路对于细胞信号级联反应至关重要，包括调节细胞增殖和分化的信号级联反应。 FGF2 减少自发分化，从而维持可无限扩增的 iPSC 培养物。因此，FGF2 是维持 iPSC 培养的关键生长因子。

神经元细胞、脑源性神经营养因子 (BDNF) 和胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)

神经元干细胞

神经元是一种重要的细胞类型，可以发送信息来控制整个身体的基本功能。神经元通常存在于脑组织中，可以由干细胞产生。多能细胞首先分化为神经祖细胞（NPC），进一步分化为神经元。 iPSC 衍生的 NPC 随后可用于构建 3D 结构图案，例如大脑类器官。生长因子信号传导维持神经元生长并指导生成的神经元类型。 BDNF 和 GDNF 是神经元分化和增殖的两种关键生长因子。

BDNF生长因子

BDNF激活多种途径，包括 MAPK、磷脂酶 Cy 和磷脂酰肌醇 3 激酶途径，调节神经元存活和分化所需的蛋白质转录。 [ 3 ]。 BDNF 促进神经元存活、轴突伸长和分支、树突棘形成和神经元可塑性。

GDNF生长因子

GDNF激活促进细胞增殖的通路，包括 MAPK、磷酸肌醇 3-激酶、ERK 和 ATK 通路 [ 4 ]。 GDNF 促进多巴胺能神经元、运动神经元和皮质神经元的存活，并增强背根神经节的轴突伸长和分支。

BDNF、GDNF、iPSC 和 NPC

BDNF 和 GDNF 用于将 iPSC 和 NPC 分化为神经元并维持高质量的后代。这些生长因子还可用于维持 3D 神经元类器官并显着驱动类器官图案化。

视网膜色素上皮 (RPE) 细胞、FGF2 和表皮生长因子 (EGF)

视网膜色素上皮干细胞

RPE 细胞是在眼睛感光层后面发现的单层细胞。它们执行许多支持神经元视网膜上的感光细胞的功能，包括类维生素A的转换和储存、散射光的吸收、微环境的维持和营养的提供[ 5 ]。 RPE 细胞以单层形式生长，一旦生长填满其边界区域，就可以长时间保持静止状态。这使得 RPE 细胞能够承受高压力条件。

FGF2 和 EGF 生长因子

FGF2通过上述 iPSC 途径促进 RPE 细胞增殖。EGF激活多种途径，包括 ERK MAPK、AKT-PI3K 和 PLC-γ1-PKC 途径，调节增殖并防止不必要的细胞凋亡 [ 6 ]。这使得 EGF 能够确保 RPE 细胞在静止期存活。 FGF2 和 EGF 是维持 RPE 细胞并为其生长创造压力最小的环境的关键生长因子。在特定条件下生长的 RPE 细胞现在被移植以治疗黄斑变性。

细胞基本操作和细胞复苏简介

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细胞基本操作和细胞复苏简介

细胞基本操作

● 细胞复苏

● 细胞密度判断及换液

● 为什么需要细胞传代

● 细胞冻存注意事项

● 常见细胞污染及处理

 

 

细胞复苏

准备工作——操作台消毒洁净，预热培养基，准备培养瓶及离心管

解冻细胞及离心——从液氮/-80冰箱取出细胞，迅速转移到37°C水浴锅中，浸没深度应超过冻存物 ，并持续摇晃直至无冻块。酒精棉球擦拭冻存管后移入操作台。向冻存管中加入1ml预热培养基，轻轻吹打，转移所有液体至离心管。常温800g离心5分钟

接种及培养——弃去上清，使用预热的培养基重悬细胞至培养瓶，立即放入培养箱。