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蛋白质印迹故障排除

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蛋白质印迹故障排除

故障排除

以下故障排除指南旨在解释蛋白质印迹中观察到的常见问题的原因和可能的解决方案。

Simple Western™ 可以克服传统蛋白质印迹法中需要排除故障的许多挑战，它可以在台式仪器内自动执行蛋白质印迹法的传统步骤。 Simple Western 使用毛细管电泳，消除了传统蛋白质印迹的凝胶到印迹转移，提供定量和可重复的结果。了解有关Bio-Techne 品牌 ProteinSimple 的Simple Western 仪器的更多信息。

无信号或信号弱

一抗浓度太低

  • 增加一抗的浓度（滴定可能有帮助）。Novus 抗体浓度试剂盒可用于增加一抗浓度。

  • 将孵育时间延长至 4°C 过夜

  • 如果一抗重复使用次数过多，则有效抗体浓度可能太低；使用新鲜抗体来改善信号

目标蛋白浓度太低

  • 每孔加载更多蛋白质（滴定可能有帮助）

  • 使用已知表达目标蛋白的阳性对照裂解物、过表达裂解物或重组蛋白

  • 确保裂解缓冲液是目标蛋白的最佳缓冲液；裂解缓冲液根据靶蛋白定位而有所不同。

  • 如果需要增加非丰度蛋白质的浓度，请使用免疫沉淀或分级分离（即核分级分离）

  • 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂

  • 确保样品未降解

蛋白质从凝胶到膜的转移不成功

  • 通过膜的丽春红染色或凝胶的考马斯染色确认蛋白质已成功转移到膜上。

  • 通过分析加载控制表达式确认等量转移

一抗和二抗不兼容

  • 确保二抗是针对产生一抗的物种而产生的

  • （例如，如果一抗是在小鼠中产生的，则使用抗小鼠二抗）

膜选择不理想

  • 检查抗原序列的疏水性/亲水性。 PVDF 膜可能更适合亲水性/极性/带电抗原，而硝酸纤维素膜可能更适合疏水性/非极性抗原

存在阻塞问题

  • 封闭时间过长会掩盖某些表位并抑制抗体结合；减少封闭孵育时间或封闭液浓度

  • 切换到不同的阻塞解决方案

膜冲洗过度

  • 随着时间的推移，检测试剂可能会变得不活跃。确保试剂新鲜。二抗可以通过将其点在膜上并与检测试剂一起孵育印迹来进行测试。

  • 处理低丰度蛋白质时，使用更灵敏的试剂（滴定可能有帮助；如果稀释，请使用高纯水）

图像曝光时间太短

  • 增加曝光时间（多次检查以达到最佳曝光时间）

抗体仅识别天然蛋白质

  • 如果使用仅识别天然蛋白质的抗体，请勿使用还原的变性蛋白质

目标是低分子量

  • 减少传输时间以防止过度传输。对于小蛋白质以及孔径较小的膜（0.2 μm 与 0.45 μm），建议使用湿转法

发生叠氮hua钠污染

  • 叠氮hua钠（通常用于储存一抗）会抑制 HRP 活性。确保充分洗涤以去除叠氮hua钠的存在或使用不含叠氮hua钠的缓冲液。

高均匀背景

阻挡不足

  • 增加封闭时间和/或温度

  • 增加封闭剂的浓度（尝试达到10%）

  • 考虑更换封闭剂（牛奶与 BSA）

  • 在抗体缓冲液中加入可选的封闭剂（也可以增加百分比）

阻止不兼容

  • 对于磷酸化蛋白质的检测，不建议使用牛奶（牛奶和酪蛋白富含磷酸化蛋白质）

由于高抗体浓度导致非特异性结合

  • 降低初级或次级的浓度（滴定可能有帮助）

  • 在抗体缓冲液中加入封闭剂

  • 通过执行二抗对照来确认二抗的特异性：省略一抗，仅将印迹与二抗一起孵育。

未结合的抗体洗涤不充分

  • 增加洗涤次数和/或时间

干膜

  • 确保在蛋白质印迹实验过程中膜永远不会变干

胶片曝光时间太长

  • 降低曝光时间（可能需要测试一系列曝光时间）

检测试剂过于敏感

  • 用纯水稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂

非特定条带/尺寸错误或多条带

目标蛋白丰度低于非特异性结合阈值

  • 在 SDS-PAGE 凝胶中加载更多蛋白质

  • 通过免疫沉淀或分级分离富集低丰度蛋白质

样品降解

  • 使用新鲜裂解物

  • 将样品放在冰上，直到样品缓冲液添加和沸腾之前

  • 如果检测磷酸化靶标，则始终包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

可能存在其他蛋白质亚型

  • 可能存在选择性剪接或多聚体形成。在这种情况下，可能需要异构体特异性抗体。

可能存在翻译后修饰

  • 预测的分子量可能受到许多因素的影响，例如糖基化、磷酸化和蛋白质加工（从前体形式裂解为成熟形式）。为了确认特异性，进行阳性和阴性对照，例如重组蛋白或过表达裂解物、下调的敲低/敲除裂解物

有斑点或漩涡的背景

膜处理不当

  • 尽量减少与膜的接触。使用干净的工具处理膜

缓冲液污染

  • 制作新鲜的缓冲液

气泡

  • 转移前滚平凝胶和膜之间的所有气泡

HRP聚合

  • 使用 0.2 μm 过滤器过滤二抗以去除聚集物

洗涤不足

  • 增加洗涤缓冲液的体积

  • 增加洗涤次数和/或持续时间

其他事宜

白色/空心带

  • ECL 底物消耗太快。降低一抗/二抗浓度或减少蛋白质用量

条带/泳道涂污（样品超载）

  • 每个泳道中加载较少的蛋白质

分子量标记泳道为黑色

  • 抗体可能与分子量标记发生反应

  • 在分子量标记和第一个样品泳道之间添加空白泳道

磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息

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磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息

反应性HMR Hm Mk Pg

灵敏度内源性

分子量（kDa）65

来源/同种型兔免疫球蛋白G

产品使用信息

应用稀释

蛋白质印迹法1：1000

Simple Western™1:10 – 1:50

免疫沉淀1:50

免疫荧光（免疫细胞化学）1:800 – 1:3200

流式细胞仪（固定/透化）1:800 – 1:3200

贮存 含有 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 叠氮化na。储存于 –20°C。不要等分抗体。

蛋白质印迹实验方案 对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育过夜，并轻轻摇动。  注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂 从样品制备到检测，您的蛋白质印迹所需的试剂现在都在一个方便的套件中：#12957蛋白质印迹应用解决方案套件  注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。  

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：( #9808 ) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：( #12498 ) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 ( #7722 ) 或红色上样包 ( #7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH 2 O稀释至 1X。

10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050 ) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：( #12539 ) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 缓冲盐水与 Tween ® 20 (TBST)：( #9997 ) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

脱脂奶粉：（#9999）。

封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 毫升，将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

洗涤缓冲液：( #9997 ) 1X TBST。

牛血清白蛋白 (BSA)：( #9998 )。

一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

生物素化蛋白梯检测包：( #7727 )。

蓝色预染蛋白质标记物，宽范围 (11-250 kDa)：( #59329 )。

印迹膜和纸：( #12369 ) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。

与 HRP 缀合的二抗：抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 )。

检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。


B. 蛋白质印迹 样品制备的通用方案。

通过添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞所需的时间。

从文化中吸取介质；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。

添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl，10 cm 直径板每孔 500 µl）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管中。保持在冰上。

超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。

微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。  

注：建议加载预染色分子量标记（#59329，10 µl/泳道）以验证

电转移和生物素化蛋白质梯（#7727，10 µl/泳道）以确定分子量。  

电转移至硝酸纤维素膜 ( #12369 )。


C. 膜封闭和抗体孵育

注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。  

I. 膜封闭

（可选）转膜后，用 25 ml TBS 室温清洗硝酸纤维素膜 5 分钟。

将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

二.一抗孵育

将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

将膜与抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 连接抗体 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育，以检测 10 ml 溶液中的生物素化蛋白质标记物室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 继续检测（D 部分）。


D. 蛋白质检测

使用指南：

在 TBST 中洗涤膜结合的 HRP（抗体偶联物） 3 次，每次 5 分钟。

通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。搅拌均匀。

将基质与膜一起孵育 1 分钟，除去多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露于 X 射线胶片。


* 避免反复接触皮肤。

ibtsystems:人类蛋白质印迹试剂盒详细介绍

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ibtsystems:人类蛋白质印迹试剂盒详细介绍

人类蛋白质印迹试剂盒<br />（猪、牛、山羊、绵羊、豚鼠、兔、驴）IGFBP

适用于人类和其他物种 IGFBP 的蛋白质印迹试剂盒

与猪、牛、山羊、绵羊、豚鼠、兔、驴 IGFBP 发生反应

 

用于检测 IGFBP 的非放射性蛋白质印迹试剂盒

应用说明 IGF0018：

 

人蛋白质印迹试剂盒

检测人类样本中的 IGFBP 和 IGF 受体。牛、猪、兔、豚鼠、绵羊、驴和山羊血清样品也获得了类似的结果。大鼠和小鼠血清在硝酸纤维素膜上仅获得微弱条带（参见：小鼠/大鼠蛋白质印迹试剂盒）。

套件内容：

试剂盒的试剂足以制备每个步骤中每种试剂250ml。这足以容纳 500 平方厘米的印迹膜。试剂盒中的每种试剂也可单独购买。

Reagent Description Quantity Product Code
A 0.5 ml Biotinylated ligand: biotinylated human IGF-II, dilute 1 : 100 to 1 : 500 10 ug BioIGF2-10
B Quenching Buffer, 2-fold conc. 125 ml  QB-125
C Blocking/Dilution Buffer, 10 – fold conc. 75 ml BDB-75
D Washing Buffer, 20-fold conc.  125 ml Product Code: WB-125
E Streptavidin-POD-Conjugate,
dilute 1:2500 – 1:5000		 125 µl Product Code: SPCON
Detailed working instructions Application Note IGF005
Human Western-ligand Blot 1 Kit Product Code: human-WLB

我们的套件不提供基材，您可以使用常用的基材

我们已经成功测试了其他基材，例如 KPL、Pierce、GE Healthcare、Seramun、Kem-en-tec。

使用您自己的缓冲区的注意事项

我们开发了一种缓冲系统，使我们手中的硝酸纤维素膜具有最佳的灵敏度，并且即使在室温下也具有长期的稳定性。也可以使用其他缓冲区，但有一些限制：

  1. 如果您使用牛血清白蛋白 (BSA) 进行封闭和/或稀释，请注意其质量。许多 BSA 制剂含有微量 IGFBP，这可能会影响 WLB 的质量（背景/信号比）。

  1. 文献中描述牛奶含有生物素化蛋白质，这可能会影响 WLB 的质量（背景/信号比）。我们测试了来自不同供应商和当地超市的脱脂奶粉，没有发现生物素化蛋白质。

金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

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金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

使用贵金属纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

由于制备贵金属纳米颗粒（例如金和银）的抗体缀合物相对容易，并且无需事先开发程序即可通过肉眼直接检测，因此这些探针在许多测定中具有很大的用途。应用包括快速测试，例如横向流动、垂直流动、蛋白质印迹和斑点印迹测定。此外，每种贵金属纳米粒子类型的光学特性 允许生成具有不同颜色的二次探针，可用于比色多重检测，图 1。

当用贵金属蛋白缀合物（例如二级金缀合物）探测印迹蛋白的膜时，在纳米颗粒探针结合后，目标蛋白的存在会以红色指示，如图 1 所示。免疫印迹和斑点印迹应用中的银到结合的金缀合物的灵敏度可与比色检测方法相媲美。此外，二级贵金属纳米颗粒蛋白缀合物很好地适应标准蛋白质印迹方案，并且对您当前的检测方案几乎不需要改变。 

与传统检测探针相比，使用贵金属纳米颗粒蛋白缀合物进行免疫印迹具有多种优势，例如： 

  • 检测无需开发

  • 检测不需要昂贵的成像设备

  • 允许比色多重分析

以下是使用二级金缀合物检测膜上抗原的标准斑点印迹方案。相同的方案可用于金纳米海胆、银纳米颗粒和合金纳米颗粒蛋白质缀合物探针。

标准免疫金斑点印迹实验方案

  1. 将 1 微升连续稀释的蛋白质（0.1 – 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。

  2. 让蛋白质滴干燥进入膜中。

  3. 在室温下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 将膜封闭 30 分钟。

  4. 与一抗在室温下孵育 2 小时。

  5. 用上述制备的封闭液清洗膜 3×5 分钟。

  6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀释的二级金结合物孵育 2 小时（或更长的时间以提高灵敏度）。注意：有关金缀合物的制备，请参阅技术说明#102。

  7. 如上所述洗涤 3×5 分钟。

  8. 干燥膜并记录数据。

  9. （可选）继续进行银增强以提高灵敏度。

金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

图 1. 使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒增强前后 Cytodiagnostics 链霉亲和素金缀合物（左上）和我们的链霉亲和素银缀合物（右上）的斑点印迹分析示例。下图展示了使用具有不同光学特性的贵金属纳米粒子缀合物的混合物同时多重检测三种不同抗原，即抗人IgG 30nm金/银(20/80)合金缀合物（绿色）、a-小鼠IgG 30nm金/银 (80/20) 合金缀合物（红色）和 a-兔 IgG 40nm 金缀合物（紫色）。

金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

图 2. 垂直流斑点印迹免疫分析中的多重检测。左图显示 3 个抗原（红点）和对照中的 2 个呈阳性检测。右图显示使用两种不同颜色的纳米颗粒探针（红色：金纳米颗粒，蓝色：金纳米海胆）对两种不同抗原的阳性检测。 

金纳米粒子的常见应用——使用金纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

图 3. 使用兔抗肌动蛋白一抗对纯化肌动蛋白进行蛋白质印迹检测，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金缀合物进行二次检测，并使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒进行增强。 

常见蛋白质印迹问题的提示和技巧

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常见蛋白质印迹问题的提示和技巧

蛋白质印迹是研究实验室普遍使用的一种技术，用于研究感兴趣的蛋白质。蛋白质印迹用于抗体验证、蛋白质-蛋白质相互作用研究以及许多其他应用。1然而，生成可解释的蛋白质印迹结果可能具有挑战性。以下是一些常见问题以及解决方法。

高背景

可能是由于 尝试这个
高抗体浓度 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
封闭液 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。
印迹在封闭/洗涤过程中干燥 确保膜在封闭和清洗步骤中被充分覆盖。
洗得不够 增加洗涤次数和洗涤液体积。确保至少洗涤 3 次，每次 5 分钟。
胶片曝光过度 尝试较短的曝光时间。

没信号

可能是由于 尝试这个
抗体浓度太低 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
样品中目标含量低 增加凝胶上的蛋白质浓度。建议滴定。
一抗和二抗不匹配 确保二抗针对一抗的宿主物种。
转移问题 使用带有颜色的蛋白质标记来检查转移。使用对照蛋白优化转移。转移前检查是否有气泡。
洗次数太多 减少洗涤次数。

多频段

可能是由于 尝试这个
凝胶超载 滴定加载在凝胶上的蛋白质样品。
使用过多抗体 使用一抗和二抗进行滴定。包括已知的蛋白质对照。
胶片曝光过度 尝试较短的曝光时间。
阻塞问题 使用新鲜的封闭液，增加封闭时间/温度，尝试不同的封闭剂。
目标蛋白的翻译后修饰 研究发表了目标蛋白翻译后修饰的例子，可以提供生物学解释（即磷酸化、糖基化、核糖基化）。
翻译后裂解 许多蛋白质被合成为前蛋白质，然后被切割成活性形式，例如前半胱天冬酶。研究针对您的目标发布的示例。
拼接变体 选择性剪接可能会产生由同一基因产生的不同大小的蛋白质。研究针对您的目标发布的示例。