小分子药物聚乙二醇化方法

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相对分子质量为200～8000或以上。由重复的乙氧基组成，不仅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有机溶剂。 PEG分子的特点如下：

①低分散性：相对分子质量（Mr）小于5000的分散性为1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性为1.1，具有较宽的范围。分布和更大的选择性；
②两亲性：既溶于有机溶剂又溶于水；
③无毒：研究表明大于1000的聚乙二醇无毒，已用于各种食品、化妆品和药品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在体内直接消除，结构不发生任何变化。分子量小于20000的代谢物可以通过肾脏代谢，较大分子可以通过消化系统代谢。

聚乙二醇化药物的特点

大多数蛋白质药物、多肽药物、化学药物都伴有一些自身无法克服的问题，如作用时间短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、无毒，具有很好的理化性质和良好的生物相容性，是美国FDA批准用于体内注射药物的少数化学品之一。因此，通过化学方法将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子药物和脂质体连接，即对药物分子进行聚乙二醇化，可以有效提高药物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以减少影响。其中，研究最多的是蛋白质的PEG修饰。与未修饰的蛋白质药物相比，聚乙二醇化的蛋白质药物具有以下优点：

（1）生物活性更强；
（2）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用；
(3)较长的半衰期；
(4)降低最大血药浓度；
(5)血药浓度轻微波动；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性较低；
(8)毒性较小；
(9) 溶解性更好；
(10)减少用药次数；
(11)提高患者依从性，改善生活质量，降低治疗费用。

聚乙二醇化方法

鉴于聚乙二醇化对药物性质的巨大影响，聚乙二醇化已成为药物开发和提高已上市药物疗效的重要途径。因此，如何进行PEG化就成为重中之重。

首先，需要选择合适的PEG进行分子修饰。修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：

（1）选择PEG相对分子质量（Mr）的确定应同时考虑生物活性和药代动力学因素。应用太大的聚乙二醇化蛋白药物会导致药物失去大部分生物活性。当使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白质药物时，修饰后的蛋白质药物与原型药物相比，生物活性和药代动力学性质没有本质变化。因此，一般选择40000-60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择应基于对蛋白质构效关系的分析。选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，使得修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常见的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和硫醇修饰；
(3) PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性取决于修饰剂的化学性质和修饰位点的选择。
(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应条件尤其是pH值的控制。一般来说，PEG修饰剂反应活性高，因此稳定性较差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性与聚乙二醇修饰的大小和类型有关。一般情况下，随着PEG相对分子量的增加，蛋白质活性的损失逐渐增加。此外，不同的PEG修饰剂对蛋白质生物活性的影响也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白质主要是通过PEG末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现的。 PEG末端羟基活性较差，必须用活化剂活化才能在体内温和条件下共价修饰蛋白质。常见的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：该方法首先用于多肽的合成，并已被证明是形成酰胺键的良好试剂。

(2)N-羟基琥珀酰亚胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亚胺碳酸酯。该反应需要在无水条件下进行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。该方法得到的聚乙二醇具有较高的活性。最好在非水环境中进行蛋白质偶联。

N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的 PEG


琥珀酸酐和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又称三氯嗪(TST)，是一种对称杂环化合物。 David 使用 TST 与聚乙二醇上的羟基发生反应。只有一个氯原子被取代，其他氯原子与蛋白质氨基反应。

(4)光气活化法：Kurfuerst提到了由N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚、三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇的方法。激活分为两个步骤，如下图所示。

(5)聚乙二醇对蛋白质半胱氨酸残基进行化学修饰。磺基特异性修饰的常见PEG活化方法如下图所示。

(6)连接酶位点的聚乙二醇：除了传统的化学修饰方法外，还可以通过酶催化等其他方式实现修饰，以G-TGase为例。

最后选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行位点特异性修饰。用活化的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行位点特异性修饰可以提高天然蛋白质的功效。蛋白质药物PEG修饰技术最大的问题是无法实现位点特异性修饰，修饰产物不均一，给分离纯化带来很大困难，也极大阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科学家在使用PEG进行修饰时，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点。这样，修饰后的蛋白质药物除了具有聚乙二醇化带来的优异性能外，还具有较高的生物活性。目前上市药物中常见的修饰位点包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非极性氨基酸的一些特定位置。

什么是生物光学标记？

生物光学标记是指用具有光学特性的标记物对生物分子进行标记，从而达到检测和识别的目的。根据应用光学特性的不同，通常可分为荧光分子标记、荧光蛋白标记、生物发光标记、化学发光标记等。根据标记目的，包括生物分子标记、生化标记、细胞学标记、形态标记等。

生命分子的探测、生命过程的观察、特定生物组织的识别通常因其微观性和隐蔽性而难以直接观察，甚至超出仪器的检测范围。它可以“脱颖而出”并借助相应仪器进行检测。

对目前检测方法可以检测到的特定生物分子、细胞或组织进行标记并检测分子和纳米颗粒，然后通过检测分子/颗粒的数量和分布来获取特定分子、细胞或组织的特征，进而获得某些区域以及细胞或生物体内分子、生化、生理指标的反应和信号。这种标记过程通常称为生物标记。生物光学标记是指用具有光学特性的标记物对生物分子进行标记，从而达到检测和识别的目的。根据应用光学特性的不同，通常可分为荧光分子标记、荧光蛋白标记、生物发光标记、化学发光标记、根据标记目的，包括生物分子标记、生化标记、细胞学标记、形态学标记等。

生物光学标记物，由于采用光学方法，借助成熟的光学高灵敏度检测仪器，可以实现高对比度、高分辨率、高灵敏度、高信噪比，方便快捷地进行检测。选择作为主要生物标志物方式。特别是荧光蛋白发现后，生物光学标记得到了快速的应用发展。 Osamu Shimomura、Martin Charfie 和 Roger Tsien 因其对绿色荧光蛋白的发现和研究而获得 2008 年诺贝尔化学奖。生物光学标签现在广泛用作生命科学和医学研究中的示踪剂。

生物光学标记研究和应用的历史
在生物研究中，科学家经常使用发出荧光的荧光分子作为生物标记。通过将这种荧光分子化学连接到其他不可见的分子上，以前不可见的部分变得可见。生物学家一直在使用这种标记方法将原本透明的细胞或细胞器“拉”出暗显微镜视野。

传统荧光分子发光时会产生有毒的氧自由基，导致观察到的细胞死亡，这就是“光毒性”。因此，在绿色荧光蛋白发现之前，科学家只能通过荧光标记的方式进行研究。死细胞的静态结构，或者其毒性作用不得不暂时忽略，而活细胞只能观察很短的时间，而荧光蛋白的光毒性很弱，非常适合标记各种活细胞。

1962 年，这种荧光蛋白在一种名为维多利亚多管发光水母的水母中被发现。其基因产生的蛋白质在受到蓝色波长光激发时会发出绿色荧光。发光过程还需要发光蛋白水母发光蛋白的帮助，而这种蛋白还需要与钙离子（Ca）相互作用。

GFP 的光毒性非常弱，非常适合标记活细胞。然而，从绿色荧光蛋白被发现到用于标记生物样品，却花了20多年的时间。 1993年，Martin Schalfi通过基因重组成功使水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）产生绿色荧光蛋白。他不仅证实了绿色荧光蛋白与生物体的相容性，而且建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法，而现代许多重大疾病都与基因表达异常有关。

后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对其进行了大刀阔斧的化学改造，不仅大大增强了其发光效率，而且开发出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白。 ，使荧光蛋白真正成为生物学家根据需要进行选择的工具箱。生物实验室常用的荧光蛋白大多是钱永健修饰的变体。

有了这些荧光蛋白，利用光学仪器，科学家们似乎在细胞中安装了“灯塔”，让它们能够实时监测各种生命过程。通过沙尔菲的基因克隆思想，科学家迄今已培育出荧光小鼠和荧光猪。
此外，除了上述荧光分子和荧光蛋白标记外，2000年以来，随着生物纳米技术的发展，一些新型的、生物相容性的光学纳米标记也得到了研究和开发，如上转换纳米粒子、量子点等。 、长延时荧光粒子等都已被研究和利用。它被用作细胞和活体的生物标记，作为生物光学成像“传感”的有力的工具。

生物光学标记的类型和应用
荧光分子/纳米颗粒标记
荧光分子包括有机试剂或金属螯合物；荧光纳米粒子包括上转换、量子点等，在紫外-可见-近红外区域具有较强的特征荧光。用这种分子/纳米颗粒标记细胞和活体后，可以实现光学示踪检测，或者激发和发射波长、强度、寿命和偏振等荧光特性可以随着极性、折射率等环境特性的变化而敏感地改变、粘度和生物检测可以利用这一特性进行。荧光分子/纳米颗粒标记设计灵活，应用方便。

生物发光标记
生物发光标记是利用荧光素酶（Luciferase）基因来标记细胞或DNA的生物标记方法。标记后，细胞合成荧光素酶，然后添加外源荧光素酶。下面，荧光素氧化后发光。该方法使研究人员能够直接监测生物体中的细胞活动和基因行为。通过该系统，可以观察活体动物中肿瘤生长和转移、传染病的发展以及特定基因的表达等生物过程。由于其操作极其简单、结果直观、灵敏度高，已广泛应用于生命科学、医学研究和药物开发。

荧光蛋白标记荧光蛋白
后将基因片段与目的基因连接，转染细胞，正常表达后，可在激发光下用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜观察检测。荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。它对活细胞无害，并且可以长时间观察。因此被广泛应用于转基因动物、融合标记、基因治疗、活细胞中蛋白质功能定位和迁移变化、病原菌侵入活细胞的分子过程等研究。荧光蛋白作为新一代基因转移报告基因和/或定位标记在生命科学研究中受到越来越多的关注

化学发光标记
将可发光的化合物附着到待检测分子（蛋白质、核酸等）上的方法。也可以连接半抗原（如生物素等），然后与酶标抗半抗原抗体或亲和素结合，与半抗原上的酶标抗体或亲和素结合。可以催化化学发光底物发生化学变化而发光。例如，抗体分子用吖啶酯标记，被触发器激活后发光，用于检测固相抗原。

血液中含有什么以及它是在哪里制造的？

血液的成分

血液是悬浮或溶解在水中的细胞、蛋白质、离子、糖、信号分子、营养物质和气体的复杂动态混合物。血液也会重新分配热量。血液的成分随着我们的饮食、运动状态、水分、一天中的时间、损伤和病原体的挑战而不断变化。血液制品除了在哺乳动物中发挥重要作用外，还具有重要的离体应用。例如，血清和白蛋白是细胞培养的重要试剂。血液是怎样制造的？血液的成分是什么？血液的这些成分从何而来？

血液的成分。血液的一些主要成分的例子。添加抗凝剂并离心后的血液外观如左侧所示。稻草色的血浆位于红细胞上方，红细胞被一层称为血沉棕黄层的白细胞隔开。成分大致按大小顺序排列，范围从细胞到包括水在内的小分子。对于抗体和较小的分子，使用空间填充分子结构。有关组件的进一步说明，请参见下表。图片来源：Cell Guidance Systems 和 Bigstock（脂蛋白和 EPO 图形）。  

血液是由许多不同的器官产生的

当血液在全身流动时，沿途的各种器官和组织都有助于其成分的产生。其中一些组织和器官，例如骨髓，主要专注于产生血液成分，而其他组织和器官，例如肝脏，则具有许多其他重要功能。血液除了携带营养、氧气和免疫系统细胞外，还携带激素、细胞因子和 RNA 等信号分子遍布全身。信号分子可以携带在细胞外囊泡例如外泌体中。这些脂质和蛋白质的小空心球与靶细胞有效融合，释放其生物活性成分。血液还将废物从组织运送到身体的器官，例如过滤和分泌废物的肝脏、肺和肾脏。所有这些成分都有不同的寿命和从血液中去除的机制。下表重点介绍了它们的功能和起源。组件按其尺寸的大致顺序列出。 

血液的主要成分、功能和来源 

什么是生物素化？

生物素化，也称为生物素标记，是将生物素共价连接到蛋白质、核酸或其他分子的过程。生物素化快速、特异，并且由于生物素尺寸小（MW=244.31 g/mol），因此不太可能干扰分子的天然功能。生物素（维生素 H）以高的亲和力、快速的结合速率和高特异性结合链霉亲和素和亲和素，这些相互作用在生物技术的许多领域中用于分离感兴趣的生物素化分子。生物素与链霉亲和素和亲和素的组合可耐受高温、pH 和蛋白水解，这使得在各种环境下捕获生物素化分子成为可能。类似地，多个生物素分子可以与靶蛋白缀合，从而可以组合多个链霉亲和素、亲和素或中性亲和素蛋白分子，提高了检测目的蛋白的灵敏度。有许多生物素化试剂可以利用各种可能的标记方法。由于生物素和链霉亲和素之间的强亲和力，生物素化蛋白质的纯化已广泛用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后事件，例如分子生物学中的泛素化。

生物素化试剂和溶解度

生物素化试剂的溶解度极大地影响标记靶蛋白或其他大分子的能力。蛋白质具有基于氨基酸侧链和蛋白质构象的疏水性和亲水性区域，并且这些区域可以基于试剂的溶解度促进或限制生物素化。此外，基于试剂的溶解度，靶蛋白微环境的疏水性可以阻止或允许生物素化。例如，表面生物素化是研究表面分子表达或内体运输的常用方法。它要求生物素化试剂是亲水性的，以防止其穿过疏水性的细胞膜，从而限制生物素标记在细胞表面。所以，合适的生物素化试剂的选择取决于目标氨基酸和蛋白质或大分子的微环境。

生物素化试剂的溶解度基于反应部分、间隔臂或两者的组合的溶解度。一些反应基团本身带电，因此是水溶性的，而不带电的基团则需要进行修饰（例如磺化）。使间隔臂可溶的常见方法是掺入聚乙二醇（PEG），它具有高溶解性和柔韧性。由PEG组成的间隔臂可以使具有不带电反应基团的生物素化试剂变得可溶，或者使具有带电反应基团的生物素化试剂更易溶解。此外，与非生物素化蛋白质相比，含有 PEG 的生物素标签带来的溶解度增加有助于防止生物素化蛋白质在长期储存过程中聚集。

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