点击化学在生物医学中的应用

什么是点击化学和生物正交化学？

点击化学：一种基于杂原子连接（CXC）快速有效合成有用新分子的化学合成方法。 [1]

生物正交化学：利用点击化学原理在生命系统内部发生的化学反应，而不干扰天然生化过程。

2001年，对自然界最喜欢的分子的研究表明，与碳-碳键相比，分子更倾向于形成碳-杂原子键。 “点击化学”概念的灵感来自于核酸、蛋白质和多糖是通过碳-杂原子键结合在一起的缩合聚合物。点击化学是一种化学合成方法，可以快速有效地合成基于碳杂原子连接 (CXC) 的有用新分子。

在此之前，化学合成复杂、困难，但收率低。直到第一代点击化学，一价铜催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC）反应被提出，复杂的反应开始通过以图案化反应方式构建功能分子来简化。然而，铜催化剂的细胞毒性限制了CuAAC反应在体外和体内的应用。

此后，化学家发现了一种应变促进的炔烃-叠氮化物环加成（SPAAC）反应，该反应无需细胞毒性铜催化剂即可发生叠氮化物-炔烃反应。该反应已用于在体外和体内标记细胞表面的糖蛋白，没有明显的细胞毒性。

然而，一些化学家对SPAAC的二级反应速率常数并不满意。因此，布莱克曼等人。开发了s-四嗪和反式环辛烯 (TCO) 衍生物的环加成反应之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德 (iEDDA) 反应，可产生比 SPAAC 反应更快的无铜点击化学反应。

图2. 目前使用的点击化学反应的特点，来源：参考文献[3]

点击化学在生物医学中的应用

点击化学在生物医学研究领域取得了重要进展，特别是无铜点击化学，包括 SPAAC 和 iEDDA 反应。在体外研究中，点击化学可以对细胞靶蛋白进行特异性标记，并研究药物靶标与活细胞中药物替代物的相互作用。此外，细胞膜脂质和蛋白质可以在体外选择性标记，并且细胞可以通过点击化学连接在一起。在体内研究中，点击化学使分子成像和药物输送能够高效且有效地进行诊断和治疗。 [3]

接下来，我们介绍点击化学在生物医学研究中的几个具体应用。

用于荧光成像的点击化学

无铜点击化学最有趣的应用之一可能是细胞内感兴趣的目标 (TOI) 蛋白质的荧光成像。 [3]特别是在 iEDDA 反应中，可以使用 TCO-配体缀合物以及随后含有 Tz 的荧光团 (FLTz) 的处理成功地观察活细胞中的先天 TOI 蛋白。

例如，临床药物AZD2281与TCO结合开发了用于研究PARP1蛋白（已知是DNA修复的重要细胞蛋白）的生物探针。 TCO 与抗癌剂紫杉醇偶联，并使用紫杉醇-TCO/Tz-BODIPY FL 组合成功地实现了细胞内微管蛋白的可视化。后来的多配体-TCO 缀合物，如 BI2536、Foretinib、Dasatinib 和 Ibrutinib，也被用于开发靶向各种 TOI 蛋白，如 Polo 样激酶 1 (PLK1)、MET 和 BTK 蛋白。 [3]

图 3. MDA-MB436 细胞中 AZD2281-TCO 和 Texas Red-Tz 之间的无铜点击反应。来源：参考文献[3]

靶向药物输送中的点击化学

点击化学已成为生物体研究中药物靶向递送的强大化学工具。点击化学的快速二阶反应速率常数、简单性和正交性可用于聚合物合成或药物载体开发过程中生物配体的位点特异性修饰。例如，2012 年，Koo 和 Lee 等人。提供证据表明体内点击化学可用于纳米颗粒递送。在该研究中，将负载 Ac4ManNAz 的纳米粒子对肿瘤细胞进行叠氮基标记，并使用含有光敏剂的 DBCO 修饰纳米粒子进行二次肿瘤靶向，依次注射到小鼠体内，叠氮基和 DBCO 之间的 SPAAC 增强了肿瘤靶向性。 [3]

图 4. 点击化学在肿瘤靶向药物递送中的应用。来源：参考文献[3]

基于点击化学的 ADC 合成

Cu(I) 催化的炔烃叠氮环加成反应 (CuAAC) 在抗体药物偶联物 (ADC) 的合成中具有巨大潜力[4]。研究人员现已设计出高效且经济高效的基于 CuAAC 的 ADC 偶联方法，并证明可以快速合成 ADC，从而促进了 GlycoConnect 偶联技术的发展。 GlycoConnect 使用天然糖基化位点实现靶向缀合，并且可以在短短几天内将单克隆抗体转化为稳定的缀合 ADC。该技术基于两个过程：首先是酶促重塑（用叠氮化物进行修饰和标记），然后是基于无铜点击化学的有效负载连接。 Synaffix 已与多家公司合作开发其下一代 ADC 技术平台，其中包括 GlycoConnect。

图 5. 根据许可协议开发的下一代 ADC

ADC Therapeutics 是较早获得 Synaffix ADC 平台技术的公司，也是目前使用该技术开发的产品数量最多的代表，其中ADCT-601已处于临床研究阶段。 [5] 目前，ADC Therapeutics 在实体瘤领域的公开产品 (3/5) 正在使用 Synaffix 的 ADC 技术。

图 6. ADC 治疗产品线

图 7. ADCT-601 的结构

基于点击化学的PROTAC合成

由于反应条件较温和且效率较高，点击化学常用于PROTAC分子的连接体中以连接分子的两端。瑞安·P·伍尔兹 (Ryan P Wurz) 等人展示了这种方法与溴结构域和末端结构域 4 (BRD4) 配体 JQ-1 (3) 以及针对 cereblon (CRBN) 和 Von Hippel–Lindau (VHL) 蛋白的连接酶结合剂的实用性 [6]。

图8.基于Click Chemistry的PROTAC合成，来源：参考文献[6]

基于点击化学的诊断

点击化学还可用于开发用于了解组织发育、疾病诊断和治疗监测的分子工具。许多癌症将膜结合微泡 (MV) 释放到外周循环中，对胶质母细胞瘤 (GBM) 等 MV 进行分析是一种很有前景的疾病诊断方法。例如，李等人。报道了一种结合 iEDDA 型点击化学和小型微核磁共振 (μNMR) 的微流体系统，用于分析 GBM 患者血液中的 MV [4]。

图 9. 单击“基于化学的诊断”。来源：参考文献[3]

概括

点击化学和非铜生物正交反应在生物医学研究领域取得了重要进展。点击化学可以对细胞靶蛋白进行特异性标记，并可用于将细胞粘附在一起，还可以实现高效且有效的分子成像和药物递送，以用于诊断和治疗目的。点击化学还可用于开发DNA纳米催化剂、基因组DNA化学合成、辅助CRISPR-Cas基因编辑、ADC和PROTAC合成等分子工具。总体而言，点击化学已成为生物医学领域和生物医学领域的重要工具。有机化学。

Biopharma PEG 作为全球点击化学试剂的供应商，自豪地培育了这种能量。我们提供用叠氮化物、炔烃、DBCO 和其他环辛炔功能化的 PEG 产品和试剂。

atto-tec产品吸收/荧光详细介绍

光的吸收
除了在部分或透明的物质上发生折射、散射、干涉和衍射现象外，还可以产生一种颜色印象，如彩虹、蔚蓝的天空、闪闪发光的肥皂泡、华丽的孔雀羽毛或薄薄的油膜和层，颜色主要通过光的吸收或反射出现在我们的环境中。

物质的“色彩”是通过选择性吸收来自电磁辐射光谱的可见部分的光而产生的。这个范围介于紫外线和红外光之间。在分子水平上，这意味着分子进入电子激发态：通过吸收光量子（光子），电子从占据的最高分子轨道上移走（HOMO = h最远 o被占用 m耳目 o比妥;能源 E1）进入最di的未占用分子轨道（LUMO= l奥韦斯特 u已占用 m耳目 o比妥;能源 E2）已提出。
 

E光子= h ⋅ υ = (h ⋅ c) / λ = ΔE = E 2 – E 1

E光子：光子的能量
h：普朗克常数
υ：辐射频率
c：光速
λ：辐射波长
ΔE：两个能级之间的能量差

被吸收的光子的能量正好对应于两个能级的能量差，即分子只能以离散的能量状态存在，能量被“量子化”，只能以规定的部分被吸收或释放。


紫外/可见光谱
可以测量光的吸收 – 例如在染料溶液中 – 可以测量。定量紫外/可见光谱的基础是朗伯-比尔定律：
 

E = lg（I0 / I） = ε ⋅c ⋅ d

E：吸光度
ε：摩尔消光系数
c：浓度
d：层厚
我0：样品前的光强度
I：样品后的光强度

通过变换方程，得到化合物的浓度c。

c = E / （ε ⋅ d）

兰伯特-比尔定律适用于单色辐射。通过绘制波长上的吸光度，可以获得不同波长的化合物的紫外/可见光谱。

朗伯-比尔定律对于高浓度溶液以及浓度依赖性反应的发生（例如 染料的聚集 代表。

当穿过溶液时，光束变弱，部分光已被溶液中的分子吸收，即忽略散射和反射：  
 

A + T = 1 = (I0 – I)/ I0 + I/ I0

A = 吸收 = 光的吸收部分 = (I 0 – I) / I 0
T = 透射 = 光的透射部分 = I / I 0

因此适用以下内容：

E = -lg (T)

Lambert-Beer 定律中的比例常数是与波长相关的材料常数，并且描述了允许激发的所谓跃迁概率。适用光谱选择规则，即区分允许和禁止的跃迁。最重要的选择规则是保持多重性（见下文）。允许的跃迁具有更高的跃迁概率，因此具有更高的消光系数。对于有机染料，长波吸收最大值处的消光系数值 > 10 5 L mol -1 cm -1；这些是共轭 π 系统中允许的跃迁。

吸收是一个非常快速的过程（10 -15到 10 -14秒），不会发生自旋反转。分子通过吸收光子吸收的能量在激发态的有限寿命后以不同形式再次释放。如果排除光化学反应，则除了以热能形式发射之外，还可能发生荧光或磷光等发光现象。这些基本的光物理过程，其中分子的化学特性保留在最后，可以用 Jablonski 图或 Jablonski 项图的形式图形表示。



其中紧挨着电子能级 S 0 – S 2和 T 1还显示了相关的振动子级别。辐射过程（波浪线）和非辐射过程（线）之间的表示有所区别。

单线态S只有成对电子，总自旋为S = 0；三重态 T 有两个不成对的电子，总自旋为 S = 1；这给出了多重性 M = 2 S + 1（存在磁场时的能级数）。 M = 1 for singlet states and M = 3 for triplet states. 因此，多重性守恒的选择规则仅允许单线态或三线态系统内的转换（“自旋禁止”）。


荧光
荧光（10 -9至 10 -7s) 表示通过从第一激发单重态 S 1的振动能级跃迁到 电子基态 S 0的振动能级 （即在等多重态之间）使受激分子失活时可观察到的光发射（“Kasha 规则”）。因此，观察到的荧光与激发波长无关。
 
GG Stokes 在发光矿物萤石 (CaF 2) 如此命名，可以根据经验与有机分子的某些结构特征相关：非芳烃不显示任何荧光；即使它们有 11 个共轭双键，如番茄红素，也不会，而芳香族化合物几乎能够发出荧光。

因此，在许多（如果不是全部）情况下，刚性和平面分子结构（通常是“芳烃”的情况）可能被视为良好荧光能力的先决条件。
此外，已经表明，将某些基团引入芳烃会削弱荧光。其中包括硝基，这意味着例如硝基苯不会发出荧光。

 
组合 (ISC)
然而，溴或碘原子也会降低荧光。然后人们谈到了内部重原子效应。这些取代基通过更大的自旋轨道耦合促进了实际上自旋禁止的转变为三线态系统。单重态系统和三重态系统的等能振动能级之间的这种相互转变被称为“系统间交叉” ( ISC) 。具有不成对电子的顺磁性物质，例如分子氧 O 2，也充当介导这种转变的催化剂。 三重态 T 1的振动基态失活中的磷光A

 

 在电子基态S 0的振动能级发生的光发射 称为磷光。与只有在激发时才能观察到的荧光不同，磷光也可以在激发结束后发生或持续很长时间（“余辉”）。这又与自旋禁令有关，导致三线态的寿命更长（10 -4到 10 2秒），从而延迟到单线态基态的失活。

 
斯托克斯位移
由于荧光或磷光总是来自电子激发态 S 1或 T的振动基态 v 01发生时，与激发带相比，发射带总是移动到更高的波长，即红移。与荧光相比，磷光移动到更长的波长。

 
内部转换 (IC)此外，可以发生称为
“内部转换”(IC) 的失活，例如，通过从第一电子激发态 S 1的振动基态 到电子基态 S 0的等能电子振动能级的转变 .然后从这种较高的激发振动水平（10 -12s) 放出热量。这种类型的无辐射失活总是比发光过程更快。这个过程似乎对流动性很强的分子特别有效。因此，在脂肪族化合物的情况下，人们发现几乎是内部转变到电子基态并且没有荧光。在大多数其他分子中，非辐射失活过程也支配着发光过程。

 
荧光染料
只有极少数有机染料的非辐射失活速度足够慢，足以保证激发态到基态的转变，在这种转变中，多余的能量通过光子的发射以荧光的形式释放出来。
荧光染料的特征在于其光谱特性，例如激发和发射光谱、荧光量子产率 (η fl ) 和荧光衰减时间 (τ fl )。染料的荧光与激发波长无关。
选择染料作为荧光标记时需要考虑的事项在相应部分中显示。

 
光谱特性
荧光染料的光谱特性在很大程度上取决于分子结构。为了使分子的吸收在可见波长范围 (400 – 700 nm) 内，基态和激发态之间的能量差必须足够低。有机染料最显着的结构特征是共轭π电子系统，即所谓的“发色团”（希腊色载体）。
在大多数情况下，染料的荧光光谱在一级近似下是最长波长吸收带的镜像，荧光通常移动 25 – 40 nm 到更长的波段。


吸收罗丹明染料
最ATTO-染料，发色团具有刚性分子骨架。许多代表属于罗丹明染料家族。这些染料的共同结构元素是呫吨骨架中心碳原子上的羧基苯基取代基。
羧基（红色）位于 2 位或邻位，显着影响所有罗丹明的物理化学性质。例如
，由于存在游离的邻位羧基，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有在处理这两种染料时必须考虑的特殊性质。用作荧光标记的有ATTO 565和ATTO 590苯基取代基的 4 位或 5 位上的额外羧基：

  

吸收波长对 pH 值的依赖性
邻位羧基的质子化-去质子化平衡影响罗丹明的光学性质发色团强。染料ATTO 565和ATTO 590



的吸收最大值位置对于染料的质子化和去质子化形式是不同的。例如，相对于质子化形式，通过两个羧基的去质子化（添加三乙胺），乙醇中ATTO 565的吸收最大值移动16 nm 至更短的波（亚光）：



染料-螺内酯平衡在平衡状态下， ATTO 565和ATTO 590
也 可以形成去质子形式的无色螺内酯：在羧酸根阴离子对中心碳进行亲核攻击的过程中形成五元环，染料的发色系统被打断, 因此形成的化合物不再被可见光吸收并发出荧光： 螺内酯的比例或这种平衡的位置在很大程度上取决于溶剂、pH 值、温度和染料结构。在极性非质子溶剂中，平衡几乎位于螺内酯一侧；在无水丙酮中是ATTO 565染料的溶液



因此，ATTO 590几乎是无色的。另一方面，在水或乙醇等极性质子溶剂中，平衡——如上所述——几乎在有色形式的一侧。
 
荧光光谱在大多数情况下，染料的荧光光谱是长波吸收带的镜像，这里以ATTO 514
为例可以很好地看出： 荧光最大值通常偏移 25 – 40 nm与吸收最大值相比更长的波。这种所谓的斯托克斯位移



进一步受到激发态寿命期间染料周围溶剂分子重新定向的影响，因此发射发生在较低能量的“溶剂松弛态”。激发期间电子分布变化越大，能量差就越大，因此斯托克斯位移就越大。这在我们的ATTO LS 染料中得到了实际应用。


荧光量子产率 (η fl )
荧光染料最重要的特性之一是荧光量子产率 (η fl )。量子产率描述了发射光子的比率 (n fl) 到吸收的光子数 (n abs )。

η fl = n fl / n abs

因此，荧光量子产率永远不会超过 100%。如上所述，非辐射失活过程经常与荧光竞争，从而降低量子产率。

高荧光量子产率对于通过荧光研究染料当然是有利和可取的。我们将在别处更详细地探讨荧光量子产率
的实验测定。荧光衰减时间 (τ fl )

 

激发后荧光光子的发射是一个统计过程。因此，单个分子保持在激发态的时间也是一个统计量。然而，如果考虑许多相同分子的集合，则会产生明确定义的衰变统计结果。在通过短激光脉冲激发后，分子数量在简单的情况下呈指数下降。激发分子的数量 (n 1 ) 下降到 1/e 系数（约 37%）之后的时间称为荧光衰减时间 (τ fl )。

n 1 (t) = n 1 (0) exp(- t / τ fl )

荧光衰减时间是染料的重要特性，可用于识别染料。我们的ATTO染料的 τ fl值通常在纳秒范围内。荧光衰减时间 的确定在别处描述。分子相互作用 荧光衰减时间与染料的荧光量子产率一样，不是一个固定的量，而是受染料所处环境（即溶剂和温度）的影响。染料的衰减时间和量子产率不是彼此独立的，而是通过以下关系相互关联的： τ fl







= τ 0 × η fl

τ 0是在没有无辐射失活的情况下发生的所谓自然衰减时间(η fl

= 100%)。 因此，荧光衰减时间的变化可以提供有关染料分子局部环境变化的信息。

什么是多糖？

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电泳基础知识简述

世界各地实验室中常用的过程之一是电泳，但很多人仍然对该过程及其工作原理存有疑问。电泳是一个复杂的过程，但对于实验室研究至关重要。

电泳是一种实验室技术，用于根据大小分离 DNA、RNA 和蛋白质等分子。凝胶电泳通过施加电流促进带电分子通过凝胶的迁移。当电流施加到凝胶上时，凝胶中的颗粒根据其电荷进行迁移。带负电的颗粒从带正电的颗粒移动到凝胶的另一端。较小的分子比较大的分子迁移速度更快，因此电泳可以根据大小分离分子。

此过程在各种实验室应用中至关重要。它使研究人员能够区分不同大小的 DNA 分子，从而可以准确地对 DNA 链进行分类和测量。为了在 DNA 分子迁移时可视化，对电泳凝胶进行染色，并根据包含已知长度片段的样品标记来判断分子。

为了确保成功的电泳，必须使用正确的设备。电泳系统配备了所有必要的工具和配件。高质量的电泳系统将提供可靠的性能和直观的控制，以促进技术人员的正确使用和可复制的电泳循环。

什么是染料聚集Farbstoff-Aggregation？

通过吸收光，染料分子进入电子激发态。吸收的能量仅存储很短的时间，并在激发态寿命结束后再次发射，例如作为荧光。

在染料溶液中，被激发的染料分子（被视为点偶极子或振荡器）如果它们之间的距离足够大，则不会相互影响。因此，整体中存在的发色团的吸收和荧光不会改变。

发色团之间的平均距离约为 5 – 10 nm，影响仅通过振荡器的“辐射场”发生，即没有直接接触。例如，通过福斯特共振能量转移（FRET）模型描述了两种染料分子之间的这种类型的相互作用。

如果发色团之间的距离变得更小，例如在非常浓缩的溶液中，则由于各个振荡器的静电力，可能会产生强烈的相互影响。由于单个染料分子的分子间相互作用，这种染料溶液的吸收和荧光行为都会发生显着变化。

罗丹明 6G 水溶液
在罗丹明6G浓水溶液的紫外/可见光谱中，在主吸收带的短波边缘可以观察到肩峰的出现。如果通过稀释溶液来改变浓度（c），并以同样的方式增加比色皿的层厚度（d），那么根据朗伯-比尔定律，人们总是可以预期相同的消光，则以下过程是观察到：等吸光点的出现。

– 所有相关物质的浓度变化是线性的，dE/dc = 0 – 表明两种（或更多）物质以一种确定的方式相互转化或彼此处于平衡状态。所以这是一个动态平衡。



解离或二聚常数可以通过实验确定：在稀释系列中，溶液的稀释始终通过层厚度的变化进行补偿，可以计算“有效消光系数”。初始浓度由未发生二聚化的高度稀释溶液的紫外光谱确定。由于各个吸收在朗伯-比尔定律中表现相加，因此可以使用反应方程或质量作用定律来制定有效消光或有效消光系数。

疏水相互作用
有机染料的聚集尤其发生在水或具有高离子强度的溶剂中。主要原因是分子间范德华力：通过所谓的“疏水相互作用”，亲脂性分子试图“避开”亲水性水分子，即为水化壳提供尽可能小的表面积。这种现象还导致玻璃表面上的染料吸附或与基质分子的非特异性结合。

形成二聚体或更高聚集体的倾向取决于
 

由于这是动态平衡（如上所述），因此可以通过稀释溶液将二聚体转化回单体。当测量的吸收光谱不再随着进一步稀释和层厚度的相应增加而变化时，达到“单体光谱”。对于大多数疏水性ATTO染料，这种情况发生在消光度约为 0.04 时（层厚 1 cm；c = 10 -7 – 10 -6 mol/l）。

蛋白质缀合物中的分子内相互作用/DOL 测定
当染料-NHS 酯与蛋白质的氨基反应时，可以形成染料缀合物，其中共价结合的染料分子非常接近并且可以彼此相互作用。这以同样的方式通过吸收光谱的强烈变化来表达，正如在 ATTO 565-steptavidin 缀合物的示例中可以清楚地看到的：在缀合物光谱中观察到额外的短波吸收带，

类似于浓度足够高的染料水溶液的“二聚体带”。由于在这种情况下共价结合的染料分子之间存在分子内相互作用，因此当缀合物溶液稀释时吸收光谱不会改变！
对于这种情况，染料-蛋白质比率（标记度，DOL）的确定在我们的“蛋白质标记“工作说明中进行了描述。


两种形式的聚集体之间存在基本区别：

H-聚集体（H = 低色），短波长。
当两个或多个染料分子以一种其跃迁偶极矩（通常在 S 0 – S 1过渡中彼此平行（沿着发色团系统的纵轴运行）。观察到向低色位移的吸收带 – 与单体吸收相反。

由于空间接近，电子结构相互影响，可以说，两个分子必须一起观察。能级被分裂，并且量子力学现在允许的吸收跃迁能量更高，因此波长更短。从这种较高的激发态，发生快速内部转换（IC），从而使荧光猝灭。

J-聚集体（根据 EE Jelley 的说法），长波
这种类型的聚集会导致吸收带的长波偏移，这与能带半宽度的显着减小有关。

J-聚集体通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或类似的发色团。Jelley 和 Scheibe 使用假异花青染料独立观察到了这一现象。对于由单个染料组装形成的“超分子聚合物”的模型描述，已经提出了各种类型。对分子关系简单的描述是这样的想法：各个分子一个接一个地排列，使得跃迁偶极矩也位于一条线上。分子的共同考虑导致能级的分裂：量子力学允许的跃迁现在能量较低，

溶剂成分、盐或其他物质的添加以及浓度会极大地影响聚集。在理想条件下，可以在紫外/可见光谱中找到所描述的极窄吸收带。此外，与 H 聚集体相比，这里当然可以观察到荧光，特别是在较低温度下：发射带的最大值也很窄，仅比吸收最大值长几纳米。
根据实验条件，文献还描述了吸收带的“加宽”，这可以通过包含 J 聚集体的禁电子跃迁来解释。

ATTO 488 标记的磷脂
溶液纯氯仿中的ATTO 488标记磷脂最初因其意想不到的颜色而令人惊讶：暗淡的溶液呈现粉红色至洋红色，而不是带有亮绿色荧光的浅黄色。长波位移吸收可以通过 J 聚集体的存在来解释。当所讨论的溶液用甲醇稀释时，颜色变为通常的黄色，并且可以看到强烈的荧光。通过改变溶剂成分，聚集体被推回。
下图显示了ATTO 488标记的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE) 在纯氯仿和氯仿/甲醇（8:2，v/v）溶剂混合物中的溶液：