酶联免疫吸附试验（ELISA）分类方法及操作要点

酶联免疫吸附测定（ELISA或ELASA）是指将可溶性抗原或抗体与聚苯乙烯等固相载体结合，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性定量检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）是免疫学中的经典实验。

酶联免疫吸附测定原理

1971年，Engvall和Perlmann发表了用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量测定IgG的文章，使1966年开发的用于抗原定位的酶标抗体技术被用于液体中微量物质的检测样品。测试方法。
这种方法的基本原理是：
①将抗原或抗体结合到某种固相载体的表面并保持其免疫活性。
②抗原或抗体与某种酶连接，形成酶标抗原或抗体，既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。
测量时，待测样品（其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按照不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。固相载体上形成的抗原抗体复合物通过洗涤与其他物质分离，与固相载体结合的酶量与标本中被测物质的量成正比。加入酶反应的底物后，底物在酶的催化下变成有色产物，该产物的量与样品中被测物质的量直接相关，因此可以根据其进行定性或定量分析。到颜色反应的深度。由于酶的催化效率高，可以大大放大反应效果，使测定方法达到高灵敏度。

酶联免疫吸附测定分类

常用的ELISA可分为以下五类：①直接ELISA； ②间接ELISA； ③夹心ELISA； ④竞争性ELISA； ⑤竞争性抑制ELISA。其他 ELISA 属于或源自这五种 ELISA 的组合。

1.直接ELISA

其方法是将抗原按一定比例稀释后包被于固相载体上，然后加入稀释后的特异性酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。直接ELISA的操作非常简单，步骤也比较简洁，但其应用范围仍然很有限。一个重要原因是这种ELISA只经过一步信号放大（酶放大），因此其灵敏度不是很高；另外，其测定的对象也很有限，只能测定酶标记的分子。

2. 间接ELISA

间接ELISA与直接ELISA的区别在于，间接ELISA中非酶标抗体与包被抗原结合，并引入了二抗（即二抗）。二抗是酶标的，可以与一抗特异性结合，最后加入底物显色并解读结果。由于二抗一般为多克隆抗体，一个一抗分子可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子可以标记多个酶分子，所以当待测抗体为多克隆抗体时，信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。此外，由于二抗的制备相对容易，并且很早就开始商业化，因此操作人员不需要进行一抗的酶标记，这大大减少了工作量。在检测抗体效价、血清效价以及筛选单克隆抗体的过程中，间接ELISA是一个非常重要的实验过程。在临床诊断中，间接ELISA也是检测标记抗体的重要手段。间接ELISA也是检测标记抗体的重要手段。间接ELISA也是检测标记抗体的重要手段。

3. 三明治 ELISA

夹心ELISA一般可分为直接夹心ELISA和间接夹心ELISA两种。
直接夹心ELISA分为双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。
双抗体夹心ELISA的方法是将一抗（捕获抗体）包被于固相载体上，封闭后加入待检测抗原，孵育后加入二抗（检测抗体）。捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单克隆抗体，或者是针对相同抗原的一种单克隆抗体和一种多克隆抗体，但检测抗体需要用酶标记。
双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗体夹心ELISA基本相同。
对于双抗体夹心ELISA，待测物必须包含两个或多个表位，否则检测抗体无法与待测抗原结合。例如，双抗体夹心ELISA无法检测半抗原和小分子抗原。对于双抗原夹心ELISA，操作与间接ELISA基本相同，但使用特异性抗原代替酶标二抗，因此特异性比间接法更好。另外，由于间接ELISA中使用的二抗一般只识别IgG，而双抗原夹心ELISA中可以检测任何类似的免疫球蛋白，因此双抗原夹心ELISA也比间接ELISA更灵敏。
间接夹心 ELISA 是基于来自两个不同物种的抗体的夹心 ELISA。洗涤后，加入另一种种属特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），然后加入底物显色。与直接双抗夹心ELISA相比，间接夹心ELISA引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗，相当于对整个系统的信号进行了一步放大系统，因此最终结果比直接双抗体夹心 ELISA 更灵敏。 。同时，由于间接夹心ELISA中酶标二抗只能识别检测抗体，而不是捕获抗体，系统的特异性也得到了保证。

4. 竞争性 ELISA

该方法首先将特异性抗体吸附在固相载体表面，洗涤后分为两组：一组加入酶标抗原与待测抗原的混合物；一组加入酶标抗原与待测抗原的混合物。另一组只加入酶标抗原，孵育、洗涤后加入底物显色，两组底物降解量之差即为待测定的未知抗原量。用这种方法测定的抗原只需具有一个结合位点。因此，该方法常用于激素、药物等小分子抗原的测定。

5. 竞争性抑制 ELISA

将抗原预包被于固相载体上，实验时加入稀释后的待检测抗原（或抗体），然后依次加入该抗体对应的特异性抗体和酶标二抗。待测样品中的抗原（或抗体）与预制备系统中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争与特定抗体（或固相载体上结合的抗原）的结合。洗掉竞争性特异性抗体，最后添加底物显色。最终的颜色结果与待检测的抗原（或抗体）的量成反比。

实验设计思路及基本步骤

无论哪种ELISA，其操作均由以下基本操作组成：①将抗原或抗体吸附到固相载体上； ②添加待测样品及后续试剂； ③孵化； ④洗涤并除去游离的未结合反应物； ⑤ 添加酶检测底物； ⑥ 结果解释。

三明治法

夹心法常用于检测大分子抗原。一般操作步骤为：

将特异性抗体固定（包被）在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗体；
添加待测样品。如果样品中含有待测抗原，它会与塑料孔板上的抗体特异性结合；
洗掉多余的待测样品，加入另一种对该抗原特异的一抗，与待测抗原结合；
洗掉多余未结合的一抗，加入酶联二抗，与一抗结合；
洗掉多余的未结合二抗，加入酶底物使酶显色，用肉眼或仪器读取显色结果。

间接法

间接方法常用于检测抗体。一般操作步骤为：

将已知抗原固定在塑料孔板上，完成后洗去多余的抗原；
添加待测样品。如果样品中含有待测一抗，它会与塑料孔板上的抗原特异性结合；
洗去多余的待测样品，加入带酶的二抗，与待测一抗结合；
洗去多余未结合的二抗，加入酶底物使酶显色，用仪器（ELISA读数器）测定塑料板中的吸光度值（OD值），评价显色终产物的含量，从而测定抗体被测试内容。

竞争法

竞争法是一种不太常用的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原。操作步骤如下：

将特异性抗体固定在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗体；
添加待测样品，使样品中的待测抗原与塑料孔板上的抗体特异性结合；
添加带有酶的抗原，该抗原也可以与塑料孔板上的抗体特异性结合。由于固定在塑料孔板上的抗体数量有限，当标本中的抗原量较多时，带有酶的抗原能结合的固定抗体就较少，即两种抗原都竞争结合塑料孔板上的抗体，这就是所谓竞争法的由来；
用酶洗去样品和抗原，加入酶底物使酶显色。当样品中抗原的量越多时，说明塑料孔板中残留的带酶的抗原越少，颜色就越深。浅的。

当需要检测无法获得两种以上抗体的抗原，或者难以获得足够的纯化抗体固定在孔板上时，一般会考虑使用竞争ELISA。

进步

亲和素是一种糖蛋白，一分子亲和素可与四个生物素小分子产生特异的亲和力，类似于抗原和抗体的亲和力。它们之间的作用力是已知比较好的非共价相互作用。 20世纪80年代后，随着生物素-亲和素系统（BAS）的发现，这种亲和力被应用到ELISA技术中，大大提高了后者反应的灵敏度和特异性。生物素很容易与蛋白质（如抗体等）共价结合。这样，与酶结合的亲和素分子与与特异性抗体结合的生物素分子发生反应，不仅起到多级放大作用，而且遇到相应的酶时，会因酶的催化作用而变色。底物，实现检测。未知抗原（或抗体）分子的用途。

结果判定

定性测定

定性判定的结果是对待测样品中是否含有待测抗原或抗体给出“是”或“否”的简单回答，分别表示为“阳性”和“阴性”。 “阳性”表示样本在检测系统中出现反应。 “否定”意味着没有反应。通过定性判断方法也可以获得半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其本质仍然是定性检测。在这种半定量测定中，样品经过一系列稀释后进行测试，产生阳性反应的最高稀释度即为效价。根据滴度可以判断样品的反应活性，这比通过观察未稀释样品的颜色深浅来判断强阳性和弱阳性更具定量意义。
在间接和夹心 ELISA 中，阳性孔比阴性孔更暗。相反，在竞争性 ELISA 中，阴性孔比阳性孔更暗。

定量测定

ELISA操作步骤复杂，影响反应的因素较多。特别是固相载体的包被很难达到个体间的一致性。因此，在定量测定时，每批测试必须使用一系列不同浓度的参考标准。在此条件下制作标准曲线。夹心ELISA用于测定大分子量物质，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点吸光度可接近2.0。常采用半对数值作图，以供试品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标。将浓度值逐点连接，得到的曲线一般呈S形，头部和尾部曲线趋于平坦，中部较为平直的部分是好的检测区域。
小分子量物质的测定常用竞争法，标准曲线中的吸光度与被测物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状根据试剂盒中使用的模式略有不同。注意ELISA测定标准曲线中横坐标为对数关系，更有利于测定体系的表达。

故障排除

1. 颜色很浅或没有颜色

(1)底物成分漏加、底物失效、底物配制浓度计算错误；
（2）整个ELISA过程中存在抗原或抗体不匹配的情况；
(3)整个ELISA过程中样品过度稀释；
(4)稀释系统错误，如使用含蛋白质的试剂进行包被。

2、全板正极

(1)酶标抗原或抗体浓度过高，尝试降低浓度；
(2)使用的封闭试剂不正确或未封闭；
（3）酶标抗原或抗体与系统中其他试剂结合；
(4)底物被酶标抗原或抗体污染。

3.显色不均匀

(1)如果ELISA板存在质量问题，重新检查ELISA板的同质性；
(2)在涂覆或加样过程中，某些孔漏气或加得少，可能是操作者不小心，或移液器漏气；
(3)加样时移液器内注入过多气泡；
（4）购买的ELISA板不正确，可能误选其他用途的板；
(5)培养过程中平板叠放过厚；
（6）样品添加或稀释过程中试剂混合不充分，或稀释梯度计算错误；
(7)洗板不当，有的孔未充满洗液或加洗涤剂后洗液未充分混合，或洗板过程中带入气泡。

4、上色太快

(1)酶标抗原或抗体浓度过高；
(2)某种试剂浓度过高。

5、上色太慢

(1)酶标抗原或抗体浓度过低，或标记效率低，或标记后影响免疫活性；
(2)试剂被污染，如HRP酶标抗原或抗体被叠氮hua钠污染；
(3)反应温度太低；
(4)底物缓冲液的pH值不正确。

6.深色背景

(1)酶标抗原或抗体浓度过高；
(2) 抗体的非特异性结合；
（3）抗原、抗体不纯；
(4)二抗的物种交叉识别。