靶向和非靶向代谢组分析技术区别

代谢组学是生物体内生化反应的集合，是生命维持生命的物质基础，是研究生命活动的重要基础。代谢组学是基于高通量分析和生物信息学技术，研究生命在内、外环境影响下的内源代谢活动，包括代谢物的类型、数量和变化的检测和分析，从而研究集体生命。活动发生和发展的本质。

代谢物是生物过程的最终产物，其状态变化可以准确反映细胞功能的变化。研究表明，包括癌症在内的多种疾病，如肝病、肾病、心血管和神经系统疾病等，都与细胞内代谢状态变化引起的生理紊乱或细胞功能丧失有关。代谢组学已成为后基因组学时代功能基因组学的研究工具，大规模筛选新生物标志物用于疾病早期预测、诊断和分型的重要手段，以及精准医疗的重要技术手段之一。

代谢组学优势

代谢物种类和数量的变化易于检测；
与基因组学、蛋白质组学相比，技术手段更简单；
与基因组学和蛋白质组学相比，代谢物数量少，易于检测、验证和分析；
代谢水平的变化可以实时揭示机体的生理和病理状态。

代谢组学分类

根据研究目的不同，代谢组学又可分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。

非靶向代谢组学是指利用LC-MS、GC-MS、NMR技术对所有小分子代谢物（主要是细胞、组织、器官或生物体中刺激或扰动前后）进行公正的检测。通过生物信息学分析筛选相对分子质量小于1000Da的内源性小分子化合物的动态变化，并进行差异代谢物的通路分析，揭示其变化的生理机制。

靶向代谢组学是对特定类别代谢物的研究和分析。两者各有优缺点，常联合使用用于差异代谢物的发现和定量，以及对后续代谢分子标志物的深入研究和分析，应用于食品鉴定、疾病研究、动物模型验证等和生物标志物发现。在疾病诊断、药物研发、药物筛选、药物评价、临床研究、植物代谢研究、微生物代谢研究等方面发挥着重要作用。
代谢组学应用方向

1.生物样品中复杂代谢物的检测。
2. 寻找疾病的生物标志物。
3. 标记验证和绝对定量研究。
4.研究代谢途径的机制。

靶向代谢组学和非靶向代谢组
学之间的区别

靶向：关注目标代谢物，通常基于通路
非靶向：发现差异代谢物并寻找生物标志物

定性定量
靶向：定性定量同时进行，可检测浓度
非靶向：可定性，相对定量

方法
针对性：需要先购买标准品，进行方法学验证，然后进行测试，成本较高
非针对性：直接进样即可分析，成本相对较低

代谢组平台比较

非靶向代谢组学常用LC/MS、GC/MS、NMR三种检测方法，优缺点如下：

1、NMR（核磁共振）
优点是对样品无损，测量无偏差，即适用于血液、尿液等液体样品，也适用于固体样品如组织器官，测量速度快，可实现样本代谢组的动态监测。缺点主要是分辨率较低。

2、GC-MS（气相色谱法）
GC-MS是一种代谢组学研究技术，具有技术成熟稳定、分辨率高的特点。同时，由于数据库比较完整，质量也较好。缺点主要是样品处理复杂、衍生化困难。对物质进行表征和定量比较困难，影响了该技术在更大范围内的使用。

3、LC-MS（液相色谱）
优点主要表现在样品制备和预处理简单、实验重复性好、分辨率高、分离分析范围宽。

非靶向代谢组分析技术

代谢组学通常需要使用多种分析技术来满足不同的实验需求。常见的代谢组分析技术包括核磁共振（NMR）、液相色谱-质谱（LC-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、毛细管电泳-质谱（CD-MS）、HILIC-MS等在。高分辨率质谱技术主要包括TOF-MS、FTICR-MS、Orbitrap-MS、Sector-MS等。

1. GC-MS（气相色谱）是代谢组学研究中的经典技术。具有技术成熟稳定、分辨率高的特点。同时，由于数据库比较完整，质量也更加准确。缺点主要是在样本上。加工过程复杂，且不易衍生化的物质难以表征和定量，影响了该技术在更大范围的应用。

2、LC-MS（液相色谱）的优点主要表现在样品制备和预处理简单、实验重复性好、分辨率高、分离分析范围广。

数据分析

数据预处理：使用XCMS、MZmine、MarkerView等工具进行原始数据处理。
差异代谢物的鉴定：常见的分析方法包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。数据分析结果还需要通过t检验和投影变量重要性（VIP）值来筛选差异代谢物。一般认为同时满足P<0.05且vip>1.0的变量为差异代谢物。
代谢通路分析：常见的代谢组通路数据库包括HMDB、KEGG、Reactome、BioCyc、MetaCyc等数据库，可用于代谢通路和相互作用网络分析。
多组学分析：多组学分析已经是组学发现的趋势。可用的数据库和工具包括 IMPaLA 网站、iPEAP 软件、MetaboAnalyst 网站、SAMNetWeb 网站、pwOMICS、MetaMapR、MetScape、Grinn、WGCNA、MixOmic、DiffCorr、qpgraph、巨大等。

关于样品

1. 微生物和细胞样品：快速灭活代谢活性（猝灭），同时防止细胞裂解
2. 动物体液（如尿液、血液、组织、器官、唾液）：采样后应迅速进行前处理，如添加抗凝剂和防腐剂，立即冷冻（-80℃）
3.植物样品：采集后快速冷冻（液氮），然后转至-80℃保存，200mg/箱
4.血清样品：500ul/箱（不少于200ul/箱），必须避免反复冻融。 （将血液收集于离心管中，静置30分钟使其凝固，然后离心取上清液装入干净的离心管中，然后8000rpm离心5分钟。-80℃冷冻保存送货。）
5、尿液样本：1ml/箱，原则上可以多取一点（尿液直接装入离心管，每管1ml，加一滴（约10ul）1/100（w/v）叠氮hua钠，冷冻-80℃）
6、瘤胃液：1ml/箱，原则上可以多取一点。收集步骤：瘤胃液6000×g离心15min，取上清液，等分，-80℃冷冻，干冰送样。为了使样品保持更长时间，可在取样后加入一滴（约10μl）1/100质量体积（w/v）叠氮hua钠溶液。

什么是代谢组学？

代谢组位于基因调控网络和蛋白质作用网络的下游，提供生物学的终端信息。那么代谢组学提供终端信息的实验过程是怎样的呢？

代谢组学的实验过程主要包括生物样品制备、代谢物分离、检测和鉴定、数据分析和生物学解释。

生物样品制备

代谢物主要通过体液排泄，因此各种易得的生物体液是代谢组学研究的主要样本。同时，各种复杂的生物组织和细胞样本，如临床或动植物实验中获得的病理组织或动植物组织等，也是代谢组样本。

由于身体的所有组织和器官都参与代谢过程，每个细胞都有其代谢产物的释放，周围的环境可以改变细胞的功能。因此，代谢谱易受多种因素影响，代谢组学研究的样本采集需要严格控制。采集样本时，需要考虑采集时间、样本保存条件和保存时间等的平行性。特别是临床生物样本不易控制，需要考虑年龄、性别、年龄等的匹配。受测患者与健康对照人群的饮食、作息习惯、体重、用药等因素之间的差异。这些因素的变化会导致代谢谱的变化，影响实验结果。

与基因和蛋白质相比，代谢物处于生命活动的下游，动态波动较大。因此，需要更多的生物学重复来提高数据的可靠性和可信度。

代谢组学研究的技术手段

根据不同的样品性质、实验目的、代谢物的理化性质，选择不同的分析鉴定技术。目前，常用的鉴定技术是色谱-质谱联用技术和核磁共振（NMR）技术。

色谱-质谱技术：利用色谱分离和质谱鉴定，可以对代谢物进行快速定性分析和准确定量。同时，由于质谱的灵敏度高，可以检测到更多的低水平代谢物。

色谱-质谱法包括液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法。

液相色谱-质谱联用仪(LC/MS)

LC/MS是一种分辨率较高的分离分析技术。具有灵敏度高、动态范围宽、无需衍生化等优点。因此，它已成为代谢组学研究中常用的技术。 LC/MS的主要分析范围包括非挥发性化合物的分析与测定、极性化合物的分析与测定以及热不稳定化合物的分析与测定。 1000Da以内的大分子量化合物的分析测定，包括蛋白质、肽、聚合物等。

气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)

GC/MS是一种质谱技术，主要用于挥发性物质的分离和鉴定。拥有较为完善的美国国家标准与技术研究院（NIST）数据库。它在代谢物鉴定方面具有一定的优势，是植物代谢组学研究中常用的分析技术。

在动物代谢组学方面，由于动物的内源代谢物大多是非挥发性的，分析样品需要经过复杂的化学衍生化处理才能实现分析，这限制了GC/MS的应用。然而，随着衍生化试剂和方法的创新，GC/MS开始逐渐应用于动物代谢组学。与LC/MS相比，GC/MS检测到的化合物主要是低极性、分子量相对较小（<300 Da）的代谢物。

核磁共振(NMR)

核磁共振（NMR）能够实现对样品中代谢物无偏差，并且所有化合物的灵敏度相同；对样品无损伤，不会破坏生物样品的结构和性质。无需复杂的预处理，可以在接近的生理条件下对生物样品进行测试；并且可以实时动态检测。

但NMR也有明显的缺点，主要表现在以下几个方面：其灵敏度比质谱低几个数量级，难以检测丰度低的代谢物；对于可检测到但含量较低的代谢物，信号较弱。同一种代谢物会产生多种信号，有些信号是不同代谢物信息叠加的结果。 NMR 可以提供结构片段的信息，但通常很难将这些片段分配给代谢物。

概括

不同的代谢组鉴定技术具有不同的特点。 GC/MS 擅长分析和鉴定挥发性和低极性代谢物，但不适合非挥发性代谢物。 LC/MS擅长分析鉴定1000Da以内的大分子量化合物、非挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物。NMR检测代谢物无偏差、无损伤、前处理简单、实时具有动态检测特性，但检测灵敏度较低。因此，应根据研究对象的特点和目的，进行更全面的代谢组分析和鉴定，灵活组合一种或多种代谢组鉴定技术，充分发挥各自的优势。

谷氨酰胺代谢与癌症治疗

1935年，Hans Krebs提出了著名的三羧酸循环（TCA），指出了谷氨酰胺代谢在动物体内的重要性。随后的研究表明，谷氨酰胺在正常细胞和癌细胞的生长中发挥着重要作用。

鉴于谷氨酰胺在能量产生和大分子合成中发挥的关键作用，针对谷氨酰胺开发的相关药物在抑制肿瘤方面具有巨大潜力。接下来我们将介绍谷氨酰胺的生理作用以及抑制剂的临床进展。

谷氨酰胺代谢

血液中高水平的谷氨酰胺提供了现成的碳源和氮源，以支持癌细胞的生物合成、能量代谢和体内平衡，从而促进肿瘤生长。

谷氨酰胺将准转运蛋白 SLC1A5（溶质载体家族 1 中性氨基酸转运蛋白成员 5）递送至细胞。

在营养缺乏的条件下，癌细胞可以通过分解大分子来获取谷氨酰胺。
Oncogene RAS 促进胞饮作用，在胞饮作用中，癌细胞去除细胞外蛋白质并将其分解为氨基酸，为癌细胞提供营养。

癌细胞吸收大量葡萄糖，但大部分碳源通过有氧糖酵解产生乳酸，而不是用于TCA循环。

过度激活 PI3K、Akt、mTOR、KRAS 基因或 MYC 通路的肿瘤细胞通过谷氨酰胺酶 (GLUD) 或转氨酶的催化，刺激谷氨酸代谢产生 α-酮戊二酸。 α-酮戊二酸进入三羧酸（TCA）循环，可为细胞提供能量。

核酸、脂质和蛋白质中谷氨酰胺的合成

谷氨酰胺可作为细胞生长和分裂过程中生物合成的原料。谷氨酰胺中的碳可用于氨基酸和脂肪酸的合成，谷氨酰胺中的氮直接作用于嘌呤和嘧啶的生物合成。

核酸合成

TCA循环和氨基转移产生的天冬氨酸是嘌呤和嘧啶合成的关键碳源。缺乏谷氨酰胺的癌细胞将在细胞周期中停滞，并且不能通过 TCA 环状中间体（例如草酰乙酸）用于核酸合成。然而，补充外源核苷酸或天冬氨酸可以缓解谷氨酰胺缺乏引起的细胞周期停滞。

此外，谷氨酰胺依赖性 mTOR 信号可以激活氨基甲酰磷酸合酶 2、天冬氨酸转移酶和氨基甲酰天冬氨酸脱水酶 (CAD)。并催化谷氨酰胺衍生的氮进入嘧啶前体合成。

脂质合成

谷氨酰胺经谷氨酰胺酶（GLS或GLS2）催化生成谷氨酰胺酶，再经谷氨酰胺酶（GLUD）或转氨酶催化生成α-酮戊二酸。 α-酮戊二酸通过催化乙酰辅酶A的反向生成，可用于直接脂质合成。

蛋白质合成

除了谷氨酰胺中的碳用于氨基酸合成外，谷氨酰胺还在蛋白质合成中发挥着关键作用。谷氨酰胺的缺乏会导致蛋白质折叠和内质网应激反应不正确。

谷氨酰胺可由尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）合成。 UDP-GlcNAc是β-O-乙酰转移酶(OGT)的底物，在内质网中的蛋白质折叠中发挥重要作用。

GCN2 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节结构域片段，与组氨酸 -tRNA 合酶类似。谷氨酰胺和组氨酸-tRNA 合成酶的结合会抑制 GCN2 酶的活性。后者在综合应激反应中起着重要作用。

谷氨酰胺和自噬

自噬与谷氨酰胺的关系错综复杂，这也体现在自噬在肿瘤发生发展中的作用。

肿瘤中自噬最矛盾的是：在某些情况下，它会导致染色体不稳定，并通过抑制氧化应激来抑制肿瘤的发展。自噬还可以通过促进胞饮作用和抑制 p53 等应激途径支持癌细胞的生存。

谷氨酰胺抑制GCN2的激活和综合应激。谷氨酰胺产生的氨可以通过自分泌和旁分泌方式促进自噬的发展。

ROS可以诱导自噬作为应激反应，但会被谷氨酰胺代谢产生的谷胱甘肽和NADPH中和。谷氨酰胺还可以间接刺激 mTOR，进而通过复杂的机制抑制自噬。

谷氨酰胺和活性氧

活性氧（ROS）介导的细胞信号在一定的生理水平下可以促进肿瘤的发展，但当水平过高时，活性氧会对细胞内的大分子造成很大的损伤。 ROS 通过多种方式产生，其中线粒体电子传递链会产生超氧 (O2−) 阴离子。

肿瘤可以通过谷氨酰胺代谢途径产生的产物来控制ROS的水平，防止高水平的ROS引起染色体不稳定。其中，谷氨酰胺控制活性氧最重要的途径是谷胱甘肽的合成。谷胱甘肽是一种可用于中和过氧自由基的三肽。

谷氨酰胺还可以通过 NADPH 影响活性氧的平衡。谷氨酰胺经过一系列反应产生的苹果酸，在苹果酸酶的催化下生成NADPH，用于调节ROS的平衡。

谷氨酰胺酶抑制剂的临床

肿瘤细胞对谷氨酰胺代谢的依赖性使其成为潜在的抗癌靶点。许多谷氨酰胺代谢的化合物，从最初的转运到随后转化为α-酮戊二酸，已成为研究热点。

尽管大多数仍处于临床前“工具合成”阶段或受到化合物毒性的限制，但谷氨酰胺酶变构抑制剂（GLS）已在临床前癌症模型中显示出巨大潜力。一种非常活跃的化合物CB-839，已进入临床试验。

人体内的谷氨酰胺酶主要有两种类型：肾型谷氨酰胺酶（GLS）和肝型谷氨酰胺酶（GLS2）。

肿瘤细胞过度激活肾谷氨酰胺酶（GLS），GLS2主要作用于非癌细胞，催化谷氨酰胺的代谢。

谷氨酰胺在能量合成、大分子合成、GLS2激活、活性氧平衡等细胞功能中的多效作用使得GLS抑制剂在联合治疗中发挥协同作用。

谷氨酰胺酶基因的抑制可以阻止上皮细胞向间质细胞的转化。此步骤是肿瘤细胞侵袭和最终转移的关键步骤。因此，预防转移可能是GLS抑制剂在与抑制谷氨酰胺代谢的联合治疗中发挥抗癌作用的重要作用。

如今，肿瘤免疫也成为最有前途的治疗方法，例如通过阻断免疫检查点PD抗体或使用工程嵌合抗原受体（CAR）T细胞。

这些方法需要免疫细胞在肿瘤微环境中发挥作用，体内的代谢抑制剂也可能广泛影响免疫功能。最近的研究表明，免疫细胞与癌细胞竞争葡萄糖，谷氨酰胺也可能具有类似的机制。

事实上，谷氨酰胺代谢在T细胞的激活和CD4+T细胞向炎症亚型转化的调节中发挥着重要作用。

谷氨酰胺对于癌症杀伤 T 细胞的激活过程至关重要。通过阻断癌细胞内的谷氨酰胺途径，增加肿瘤微环境中氨基酸的含量，增强免疫细胞的杀伤作用。

结论

九十年前，瓦尔堡发现许多动物和人类肿瘤对葡萄糖有非常高的亲和力，将大量葡萄糖分解成乳酸。他还指出，癌症是由代谢变化和线粒体功能丧失引起的。

人们重新发现了线粒体生理氧化功能对于癌症的重要性。而且谷氨酰胺在肿瘤细胞的生长中也发挥着重要作用。这些武断的观点在过去的几十年里已经被取代和完善。

谷氨酰胺在细胞功能中的多效性作用，如能量合成、大分子合成、mTOR 激活和活性氧平衡。

肿瘤细胞过度激活肾谷氨酰胺酶（GLS），而正常细胞催化谷氨酰胺代谢的是肝谷氨酰胺酶（GLS2）。临床上有可能选择性开发GLS抑制剂。

靶向抑制某些癌基因使肿瘤细胞对谷氨酰胺产生依赖，因此靶向抑制剂与谷氨酰胺代谢相结合具有合成致死作用。

由于肿瘤发病机制的复杂性，谷氨酰胺在人体内的生理机制尚不清楚。例如，13年清华大学施一公教授指出，谷氨酰胺代谢的主要作用是利用生成的胺来对抗肿瘤的酸性环境。因此，GLS抑制剂与其他靶点的联合应用已成为发展趋势。