Reduced Glutathione Assay Kit 还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒

货号： JP8013-100T 品牌： Jinpan 标签： 生化试剂

描述

Reduced Glutathione Assay Kit

还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒

产品信息

产品描述

谷胱甘肽（Glutathione, Glutathione）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的一种三肽。是最小的细胞内蛋白巯基分子，能够预防活性氧比如自由基和过氧化物引起的细胞损伤。谷胱甘肽以还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种状态存在。还原型谷胱甘肽（GSH）是主要的组织抗氧化剂，为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）催化脂质氢过氧化物还原生成醇化合物和过氧化氢生成水提供还原当量物。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）催化反应中，两个GSH之间二硫键的形成使生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。而谷胱甘肽还原酶（GR）同时在β-NADPH₂的氧化下将GSSG再循环生成GSH。当细胞暴露于逐渐提高的氧化应激下，GSSG累积，引起GSSG/GSH水平增加。GSSG/GSH增加程度可用作氧化应激水平的指示剂。因此，监测生物样本内GSH和GSSG的水平至关重要，能够用于评估细胞和组织应对氧化应激和自由基介导的细胞损伤上的氧化还原和解毒状态。

本还原型谷胱甘肽检测试剂盒（Reduced Glutathione Assay Kit, GSH Assay Kit）是一款简单便捷的还原型谷胱甘肽测定试剂盒，检测原理是：待测样本内的还原型谷胱甘肽（GSH）与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成稳定的黄色的TNB和GSSG，通过酶标仪测定410nm处的吸光度，并且与相应处理的GSH标准做比较，得到样品中的GSH含量。本试剂盒适用于测定血浆、血清、动植物组织、细胞等样本内的GSH含量。

试剂盒组分

保存与运输方法

保存：-20℃保存，6个月稳定。推荐根据各组分的保存方法归位保存。

运输：冰袋运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 试剂准备

1.1 配制 GSH 标准储存液

将低温保存的还原型谷胱甘肽标准（GSH Standard）回温至室温。往10mg 还原型谷胱甘肽标准加入3.25ml ddH₂O，溶解并混匀，即得到：还原型 GSH 标准储存液（10mM）。一部分立即使用，剩下的请根据单次用量适当分装后，-20℃保存，避免反复冻融。

1.2 配制 DTNB储存液

往10mg DTNB 中加入1ml DJPO，溶解并混匀，即得到：DTNB 储存液（10mg/ml）。一部分立即使用，剩下的请根据单次用量适当分装后，-20℃保存，避免反复冻融。

1.3 配制 GSH检测工作液：按下表配制本工作液。

1.4 配制蛋白沉淀工作液

往2.5g 蛋白沉淀剂中加入 50ml ddH₂O，配制成 50ml 5%的水溶液，即得到：蛋白沉淀工作液，置于4℃保存。

1.5 配制标准品

把还原型 GSH 标准储存液（10mM）用蛋白沉淀工作液稀释成 50μM 标准溶液，然后依次稀释成 25、 15、 10、5、2μM GSH 溶液，取 50、 25、 15、 10、 5、 2μM GSH 标准溶液 6 个点做标准曲线。【注意：由于 GSH 标准在蛋白沉淀工作液中不是很稳定，用蛋白沉淀工作液配制的 GSH 溶液必须新鲜配制，不可冻存后再使用。】

1.6配制 NADPH 工作液

往10mg NADPH 中加入 1ml ddH₂O，溶解并混匀，即得到：NADPH 储存液（10mg/ml）。一部分立即使用，剩下的请根据单次用量适当分装后，-20℃保存，避免反复冻融。按 0.1ml NADPH 储存液（10mg/ml）加入 8.23ml GSH assay buffer的比例加量，充分混匀，即得到：NADPH 工作液（0.12mg/ml）。

2. 样本准备

2.1 红细胞或血浆样品

取新鲜血液，600g离心10min，沉淀为红细胞，上清为血浆。对于红细胞，用 PBS 洗涤两次，取约 50μl 红细胞沉淀或血浆，加入50μl 蛋白沉淀工作液，充分涡旋振匀。4℃或冰浴放置10min， 4℃ 10000g 离心10min，取上清，用于GSH测定，样品需暂时4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的红细胞样品最后需用蛋白沉淀工作液稀释 10倍后再进行后续的测定，而对于血浆样品，应直接取10μl 进行测定。

2.2 动植物组织样品

取组织用液氮速冻，迅速研磨，按每40mg加入100μl 蛋白沉淀工作液（亦可不用液氮，而是直接加入蛋白沉淀工作液至组织后匀浆或研磨），充分涡旋振匀，再加入300μl 蛋白沉淀工作液，用匀浆器充分匀浆。4℃孵育 10min，4℃ 10000g离心10min，取上清，用于GSH测定。样品需暂时 4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10 天。对于处理好的组织样品通常需用蛋白沉淀工作液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常为 5-20倍。

2.3 细胞样品

PBS洗涤细胞1次，离心收集细胞，吸尽上清，加入细胞沉淀 3倍体积的蛋白沉淀工作液，充分涡旋振匀（收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量，10mg细胞沉淀的体积可以粗略看做10ml）。对样品进行快速的冻融后， 4℃或冰上孵育5min，4℃ 10000g 离心10min，取上清，用于 GSH测定。样品需暂时4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的细胞样品通常需用蛋白沉淀工作液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常为 5-20 倍。

3. GSH加样

取 96 孔板，按照下表设置空白孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的GSH 浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

4. GSH检测

立即用酶标仪或自动生化分析仪测定 410nm处吸光度，每隔 2min 检测 1次，空白孔调零，共检测 6min（亦可加入 NADPH 工作液反应 6min 后检测，只检测 1次），以检测其反应速率ΔA/min。如果酶标仪不能检测 410nm，可测定 405-420nm处吸光度。

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