细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性难题，也是让每个细胞实验室工作者头疼的问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它不同于细胞，也不同于病毒。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。

对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。有实验人员试用了红霉素。结果发现使用红霉素有一定的效果，细胞生长很快，状态明显好转。但红霉素不能完全根治支原体感染，停药后一段时间支原体又复发了。用四环素也遇到了类似的问题。也有发现庆大霉素和卡那霉素对于抑制支原体的生长具有一定的效用，但是效果也不是很明显，毕竟氨基甙类不能完全的抑制甚至杀灭支原体。

伴随着新一代支原体专用抗生素的诞生，一些新的抗生素开始进入细胞实验室，如InioGen公司的M-Plasmocin，Applichem的Myco-3等，这一类的抗生素属于氟喹诺酮类环丙沙星类抗生素，很多细胞培养污染相关的支原体对该抗生素敏感，该抗生素无毒副作用。Applichem的Myco-3支原体清除试剂是100倍浓缩液，可直接加入培养基中稀释即可使用，每2-3天换液一次，连续处理2周左右，可有效清除大多数支原体污染，简单易操作。

对于顽固性的支原体污染，或者单独使用新型支原体抗生素效果不是很理想的，推荐使用抗生素联合使用。其实一些在医药上已经被广泛使用的支原体抗生素，比上述广谱性的抗生素在支原体的处理上具有更好的效果。泰妙菌素是一种双萜类动物专用抗生素，作为世界十大兽用抗生素之一，对革兰氏阳性菌、支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌有较强的抗菌作用，特别是支原体。另一种支原体抗生素米诺环素，其抗菌谱与四环素相似，但是对于支原体的抑制效果更好，一般来说，这两种抗生素的联合使用会起到很好的支原体清除效果。具体应用于被顽固支原体污染的细胞，先用Applichem的Myco-1连续处理4天后换Myco-2处理3天，如此重复2-3次即可完全清除细胞内的支原体污染。

除了支原体抗生素类的清除试剂，上海金畔生物科技有限公司还向您推荐AppliChem的其他更完整的细胞支原体污染解决方案，其PCR Mycoplasma Test Kit能通过高度灵敏的支原体基因保守序列，提供给你即用型的PCR Mix试剂盒，能快速检测您的细胞或者样品是否被含有支原体；另外AppliChem还提供针对细胞培养过程中各个可能支原体的污染源进行消毒的产品，如针对CO2培养箱的喷雾消毒产品、培养箱内的水源消毒溶液以及水浴箱等设备的消毒试剂，为您提供一站式的支原体解决方案！

如果你对AppliChem的支原体检测、消毒及清除产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询支原体相关的最优解决方案，或索取最新的艾普力（Applichem）产品目录。

   细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

   支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它不同于细胞，也不同于病毒。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。

    很多实验室都曾遇到过细胞培养的支原体污染，也都曾试用过多种抗生素。考虑到支原体肺炎的首选药是红霉素和四环素，有实验人员试用了红霉素。红霉素确实具有一定的抑制支原体的效果。使用一段时间后，细胞状态明显好转。但红霉素不能完全根治支原体感染，停药后一段时间支原体又复发了。用四环素也遇到了类似的问题，不能根治。因为支原体对氨基甙类有中度敏感，因此这类抗生素也曾被考虑使用，其代表抗生素庆大霉素和卡那霉素对于抑制支原体的生长具有一定的效用，但是效果不是很明显，毕竟氨基甙类不能完全的抑制甚至杀灭支原体。

   实验室的主要工作抗生素不外乎以上几类，对于支原体污染的清除效果上也有限制，其实一些在兽医和医药上已经被广泛使用的支原体抗生素，可能比以上的广谱或较为广谱性的抗生素在支原体的处理上具有更好的效果，如泰妙菌素和米诺环素。泰妙菌素是一种双萜类动物专用抗生素，主要用于防治家畜家禽呼吸系统疾病和动物促生长。作为世界十大兽用抗生素之一，泰妙菌素对革兰氏阳性菌、支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌有较强的抗菌作用，特别是支原体。而米诺环素(盐酸二甲胺四环素，美满霉素)，其抗菌谱与四环素相似，但是对于支原体的抑制效果更好，一般来说，这两种抗生素的联合使用会起到很好的支原体清除效果。

   Applichem的Myco系列专门针对细胞实验室支原体污染。其Myco-1和Myco-2系列在泰妙菌素和米诺环素的基础上进行了修饰优化，进一步提高了其清除支原体的能力；同时对其联合使用的配比也进行了优化，使其比市场上的支原体清除系列具有更好的支原体清除效果，同时对细胞自身的生长代谢影响降到了最低。据一些使用者反映，其联合使用的效果比目前市场上新一代支原体专用抗生素（如Applichem的Myco-3系列）单独使用的效果更好，特别是针对顽固支原体，通过Myco-1和Myco-2的联合使用，可有效清除被污染细胞内的支原体，拯救珍贵细胞。

   如果你对Myco系列支原体检测、消毒及清除产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询支原体相关的最优解决方案，或索取最新的艾普力（Applichem）产品目录。

什么是支原体？

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径 0.2μm)并独立生活的微生物，没有细胞壁，表面由胞质膜构成，约有 1%的支原体可通过滤菌器。支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著。细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。支原体污染细胞后会影响下游试验结果。

为什么要重视细胞培养中的支原体污染？

1、污染率高：在细胞研究领域，支原体是臭名昭著的污染源，二十世纪九十年代的支原体污染率是四分之一，而目前有仍然有超过十分之一的基因表达研究（许多曾发表在顶尖杂志上），表现出支原体污染的迹象；

2、影响日趋严重：虽然支原体污染并不一定意味着研究结果无效，但它会影响数百个基因的表达，并与细胞竞争营养阻碍细胞的生长。在目前测试的一组受污染的数据中（淋巴瘤细胞），已经鉴定出 61 个被支原体改变的基因，干扰了实验结果。这无疑是对时间，资源，经费很大的浪费；

3、难察觉：支原体污染完全是不留痕迹的，污染后的细胞生长速率一般并未发生显著的影响，无法用肉眼识别，除非采用专门的支原体检测方法检测；

4、污染源多：“草率操作”、细胞系流通的交叉污染、操作人员自身都是很重要的污染源；

5、难去除：支原体体积小，无细胞壁，约有 1%的支原体可通过过滤器，且一般抗生素根本无法有效抑制或者去除支原体，另外，部分抗生素使用后会对细胞产生敏感效果，从而影响细胞的状态；

6、重视程度日益增加：学术杂志发表实验结果需验证支原体污染影响，在国际上，支原体污染检测已经日益成为细胞培养污染常规检测之一，同时也是有效规避支原体污染的重要方法之一。

世界性难题！！！！Nature 収布癿文献表明细胞研究领域中存在严重的支原体污染问题

Ewen Callaway. Contamination hits cell work. Nature, 29 July 2014; doi:10.1038/511518a

如何保护细胞细胞不受支原体的污染？

上海金畔生物科技有限公司代理的德国 PanReac Applichem 所提供 Myco 系列支原体清除产品可以直接整合到质膜上破坏支原体的完整性，从而有效地清除支原体污染，而且没有细胞毒性。另有支原体检测与预防系列产品可以给细胞提供更多的安全保护。

一、AppliChem 支原体清除系列

对于普通细胞系，遭受污染以后可以通过重新复苏，购买等途径更换样本，但是对于一些较难获得的珍贵样本，如干细胞，原代细胞，经过特殊处理的，或订购困难的细胞，一旦遭受支原体污染后，一定要马上进行处理。AppliChem研发的支原体清除的 Myco 系列产品，可以直接整合到质膜上破坏支原体的完整性，从而有效的清除支原体污染，并可以针对不同程度，不同细胞样本进行针对性处理，处理过程简单，对细胞不会造成任何副作用。

二、AppliChem 细胞污染预防系列

有效保护细胞的最好方式是对于细胞培养环境的预防，如工作环境定期消毒处理，严格实验操作，保证器皿无菌等各方面。在实验室中，CO2 培养箱，CO2 培养箱水盘，水浴锅是非常重要的污染源。AppliChem 研发有系列污染预防系列产品专门针对这 3 大污染源，可有效预防真菌（及芽孢）、细菌、病毒等污染。使用方便，无腐蚀性，安全高效。
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三、Applichem 支原体检测系列

传统的支原体检测方法包括支原体分离培养、支原体特异酶检测、DNA 荧光染色检测以及 PCR 检测，除 PCR 检测方法以外，其他检测方法大多耗时长，要求检测人员具有丰富的经验，并且无法获得足够的灵敏度和特异性，对于一些稀有的支原体亚种无法有效检测。

AppliChem 设计的支原体检测试剂盒系列产品均是基于 PCR 方法，根据支原体 16S rRNA 保守序列设计引物，经过 PCR 反应扩增其 16S rRNA 片段，后采用琼脂糖电泳方法检测 270bp 条带。相对传统方法而言，具有强大优势：

• 高灵敏度：敏感度高达 100~1000CFU/ml，仅需  要 0.5 – 1.0 ml 细胞上清样本即可检测；
• 检测品种广泛：可检测常规品种，同时对于稀有  亚 种 也 能 同 效 检 测 ， 如 M. pneumoniae,  Acholeplasma laidlawii, M. synoviae, M. pulmonis,M.bovis，几乎覆盖自然界 80 余个品种；
• 快速：操作时间只需 30 分钟，全程 5 个小时内  即可得到检测结果；
• 可靠：试剂盒中包括有阳性对照 DNA，可保证  实验结果的可重复性，减小因操作带来的误差；
• 安全性：无支原体培养过程，有效避免污染扩大。

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上海金畔生物科技有限公司是PanReac Applichem 中国一级代理商，为用户提供完善的技术支持与售后服务。如对产品感兴趣欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

德国Applichem提供支原体检测/清除/预防全系列产品，给您的细胞更多的安全与保护

为什么要重视细胞培养中的支原体污染？

您的实验结果是否能保证没有受到支原体污染的影响？

世界性难题！！！！Nature最新发布细胞研究领域中支原体污染问题严重性

Ewen Callaway. Contamination hits cell work. Nature, 29 July 2014; doi:10.1038/511518a

1. 污染率高：在细胞研究领域，支原体是臭名昭著的污染源，二十世纪九十年代的支原体污染率是四分之一，而目前有仍然有超过十分之一的基因表达研究（许多曾发表在顶尖杂志上），表现出支原体污染的迹象。
2. 影响日趋严重：虽然支原体污染并不一定意味着研究结果无效，但它会影响数百个基因的表达，并与细胞竞争营养阻碍细胞的生长。在目前测试的一组受污染的数据中（淋巴瘤细胞），已经鉴定出61个被支原体改变的基因，干扰了实验结果。这无疑是对时间，资源，经费极大的浪费；
3. 难察觉：支原体污染完全是不留痕迹的，污染后的细胞生长速率一般并未发生显著的影响，无法用肉眼识别，除非采用专门的支原体检测方法检测；
4. 污染源多：“草率操作”、细胞系流通的交叉污染、操作人员自身都是很重要的污染源；
5. 难去除：支原体体积小，无细胞壁，约有1%的支原体可通过过滤器，且一般抗生素根本无法有效抑制或者去除支原体，另外，部分抗生素使用后会对细胞产生敏感效果，从而影响细胞的状态；
6. 重视程度日益增加：顶尖杂志发表实验结果需验证支原体污染影响，在国际上，支原体污染检测已经日益成为细胞培养污染常规检测之一，有效规避细胞支原体污染。

支原体检测系列

传统的支原体检测方法包括支原体分离培养、支原体特异酶检测、DNA荧光染色检测以及PCR检测，除PCR检测方法以外，其他检测方法大多耗时长，要求检测人员具有丰富的经验，并且无法获得足够的灵敏度和特异性，对于一些稀有的支原体亚种无法有效检测。

Applichem设计的支原体检测试剂盒系列产品均是基于PCR方法，根据支原体16S rRNA保守序列设计引物，经过PCR反应扩增其16S rRNA片段，后采用琼脂糖电泳方法检测270bp条带。相对传统方法而言，具有强大优势：

a)    高灵敏度：敏感度高达100~1000CFU/ml，仅需要0.5 – 1.0 ml细胞上清样本即可检测；

b) 检测品种广泛：可检测常规品种，同时对于稀有亚种也能同效检测，如M. pneumoniae, Acholeplasma laidlawii, M. synoviae, M. pulmonis, M. bovis，几乎覆盖自然界80余个品种；

c)     快速：操作时间只需30分钟，全程5个小时内即可得到检测结果；

d)可靠：试剂盒中包括有阳性对照DNA，可保证实验结果的可重复性，减小因操作而带来的误差；

e)    安全性：无支原体培养过程，有效避免污染扩大；

支原体清除系列

对于普通细胞系，遭受污染以后可以通过重新复苏，购买等途径更换样本，但是对于一些较难获得的样本，如干细胞，原代细胞，经过特殊处理的，或订购困难的细胞，一旦遭受支原体污染后，一定要马上进行处理。Applichem研发的支原体清除的Myco系列产品，可以直接整合到质膜上破坏支原体的完整性，从而有效的清除支原体污染，并可以针对不同程度，不同细胞样本进行针对性处理，处理过程简单，对细胞不会造成任何副作用。

细胞污染预防系列

有效保护细胞的最好方式是对于细胞培养环境的预防，如工作环境定期消毒处理，严格实验操作，保证器皿无菌等各方面。在实验室中，CO₂培养箱，C0₂培养箱水盘，水浴锅是非常重要的污染源。Applichem研发有系列污染预防系列产品专门针对这3大污染源，可有效预防真菌（及芽孢）、细菌、病毒等污染。使用方便，无腐蚀性，安全高效。

作为著名的生化试剂供货商，AppliChem为多家制药、化工等知名企业以及生物技术、生化试剂等著名品牌，如美国Sigma、德国Merck等提供产品。除了作为全球知名生化产品的OEM供货商，全世界还有成千上万的公共科研机构、大学以及生物技术公司通过直接订购，正在使用AppliChem的优质产品和服务。

作为Applichem的中国一级代理商，上海金畔生物科技有限公司为您选择最优的实验室生化试剂解决方案。在Applichem的众多化工、生化及分子生物学等试剂中，除了质量优质、价格低廉外，还有很多特色生化试剂和细胞实验室解决方案。上海金畔生物科技有限公司根据国内科研的现实需求，为客户选择最具性价比的生化试剂和产品解决方案。伴随着与AppliChem合作的加深，不管是在价格、供货质量保障、供货时间以及售后服务方面，上海金畔生物科技有限公司都能为您提供最值得信赖的产品服务。如需了解更多信息请致电021-50837765。

一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染很容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染，据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是最主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂慢慢蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。

狡猾的支原体

支原体是一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小，而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。

检测、检测、再检测

对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心，它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明没有支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。

支原体检测：

检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析，ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该是检测支原体的理想方法，他综合了几个优势，灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可以直接用来检测，非常方便。Applichem公司提供的高灵敏度PCR Mycoplasma Test Kit（A3744）,该试剂盒引物源于支原体基因的保守序列，而且即用型的PCRmix使您的使用更加方便，同时更是提供了阳性对照。当然为了避免假阳性和假阴性，试验中必须设立多种对照：除了阳性对照外，还有阴性对照和内对照。

用Hoechst33258染料检测支原体是很多教科书上推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechest33258染料结合，在500倍数放大情况下，表现为细胞颗粒或纤毛染色。但操作过程较为繁琐，且需要一定的经验辨别支原体，新手可能大不容易掌握。

支原体污染和清除：

如果很不幸，你的细胞已经感染了支原体，怎么办？大部分人的想法可能都是把感染的细胞扔掉，重新开始。一旦感染了支原体，细胞复原的机会很小。所以在液氮中多储存一些备份还是比较明智的选择。

如果你的细胞非常稀有且珍贵，那只能去奋力抢救了。拿什么拯救你，我的细胞？由于支原体没有细胞壁，且代谢慢，故大部分传统的抗生素都不奏效。但是上海金畔公司提供了一些Applichem的支原体清除试剂。Myco-3（A5240），Myco-1（A5222）Myco-2(A5233)。这三类支原体清除试剂是有多种支原体敏感的抗生素研制而成，无细胞毒性。100倍浓缩液直接加入培养基，使用方便。具体的使用方法如下：

Myco-3加入培养基中，每2-3天换液一次，连续处理14天，可有效清除绝大多数支原体污染。

顽固支原体需Myco-1和Myco-2联合使用：Myco-1处理4天后换Myco-2处理3天，如此重复2-3次。

支原体预防：

虽然说支原体可以铲除，但这种劳心劳力的事情估计没有人愿意做，那么平时的预防更重要。上海金畔公司还提供了几样好东西，能预防支原体的污染。具体介绍如下Incubator-Clean（A5230）

用于CO2培养箱的消毒，喷一喷，彻底预防支原体、细菌和病毒等的污染。

Incuwarter-Clean（A5219）

用于CO2培养箱内保持空气湿度的水源消毒，100*即用型浓缩液。

Aquabator-Clean（A5225）

用于水浴的消毒，有效防止各类污染。

需要特别提及的是，液氮罐中也可能有支原体。支原体能耐受液氮的低温，虽然不会增殖，但会污染你的细胞。因此，细胞冻存管还是不要放在液氮内，以免液氮渗进入细胞，而是储藏在液氮的气相中。

不过，预防支原体污染的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。下面我将上海金畔公司提供的有关支原体预防，检测和清除的产品做一个总结：

支原体预防：

支原体检测：

支原体清除：

除了支原体预防，检测和清除方面的试剂外，上海金畔公司还提供了Applichem细胞培养相关方面的其他试剂，包括各种细胞培养基，氨基酸，抗生素以及糖和盐类。同时也包含了常用的其他生化试剂，如有需要可随时拨打我们的电话：021-50837765.