纳米抗体特征及应用

纳米抗体是骆驼和鲨鱼中天然发现的纯重链抗体 (HcAb) 的重组可变域。纳米抗体的分子量仅为15 kDa，约为常规抗体分子量的1/10，是已知分子量最小的天然抗体。纳米抗体在结构上不同于传统抗体，表现出更高的亲和力和稳定性、微生物表达性、免疫原性低、水溶性好、组织穿透力强等特点，在疾病治疗、诊断、物质检测等领域备受关注。

纳米抗体结构特征

Camelid HCAb 由片段可结晶区 (Fc) 组成，该片段直接连接到由单个 VHH 结构域组成的 Fab 片段。由于缺少轻链和 CH1 区域，纳米抗体的分子量比传统单克隆抗体降低了 90 kDa。 HCAb 的 VHH 片段大小约为 2.5*4 nm，分子量约为 15 kDa，可结合广泛的抗原库。与传统抗体的可变区 (VH) 类似，纳米抗体 (Nbs) 由四个保守框架区 (FR) 和三个负责确定抗原特异性的高变互补决定区 (CDR) 组成。

同时，纳米抗体与单克隆抗体的VH片段也存在一系列差异。首先，由于缺乏轻链，纳米抗体通过三个CDR区与抗原结合，而单克隆抗体通常需要六个CDR区才能与抗原结合。在结构上，尽管不存在轻链，但纳米抗体的 CDR1 结构变异和 CDR3 长度的增加极大地促进了其抗原结合的多功能性。另外，常规mAb的VH结构域的FR2主要由疏水性氨基酸残基组成，即V37/G44/L45/W47，而纳米抗体的VH结构域的FR2通常由亲水性氨基酸残基组成，即F37/E44/R45/ G47，这也使得它们以可溶性单体的形式存在。

纳米抗体：优点和缺点

纳米抗体的结构与传统单克隆抗体相比具有多种优势。

更高的组织渗透性： mAb 的尺寸较大且 Fc 区域的存在改善了药代动力学特性，但也影响了其组织渗透能力。较小尺寸的纳米带可实现更高的组织穿透性和更强的体内细胞杀伤力。

增强的抗原识别能力：在所有互补决定区中，CDR3占抗原识别特异性的60-80%。长而延伸的CDR3环赋予了更好的抗原识别特异性和对VHH的亲和力，从而增强了对隐藏肿瘤抗原表位的识别。

稳定性强：与mAb相比，Nbs具有显着更高的热稳定性、Tm值和可逆热变性。此外，Nbs 能够抵抗蛋白酶、pH 值和疏水剂的变性作用。

能够串联成多特异性或多价配置：与 mAb 相比，Nb 的尺寸较小，有利于与多个功能不同的抗体结构域串联以实现多功能药物递送，增强亲和力，同时避免快速肾脏清除并增加药物比率。

尽管纳米抗体具有许多理想的特性，但也存在某些局限性。由于肾小球滤过的阈值是 50-60 kDa，15 kDa 的小尺寸会导致血清持续时间短或肾脏清除快，从而在诊断筛查和治疗应用中存在缺点。一种解决方案策略是将纳米抗体与聚乙二醇（PEG）或白蛋白偶联。其次，纳米抗体缺乏 Fc 区，因此无法执行与该部分相关的效应器功能。然而，这个问题可以通过与Fc区偶联来提高治疗能力来解决。
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纳米抗体的应用

1. 用于诊断应用的纳米抗体

基于纳米抗体的免疫分析可以充分利用来检测和识别靶标以及临床上较难检测的外来病原体或毒素。例如，EGFR在许多肿瘤中过度表达，是肿瘤药物靶向的有吸引力的靶点。针对 EGFR 的纳米抗体已被开发并成功应用于乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的诊断。此外，纳米抗体还用于分子成像技术，例如用于疾病诊断的正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、近红外荧光（NIR）和超声分子成像。

2. 纳米抗体的治疗应用

纳米抗体的高亲和力和特异性使其更容易靶向结合阻塞部位的癌细胞上的受体并渗透到血管较少的组织中。同时，鉴于纳米抗体的低免疫原性，检测到对小鼠重复施用纳米抗体并没有诱导任何体液和细胞免疫反应，这对于疾病的治疗很重要。

A. 基于纳米抗体的药物递送

将纳米抗体修饰到纳米药物载体（例如，脂质体、胶束、基于白蛋白和铁蛋白的纳米粒子以及基于聚合物的多聚体）使得基于纳米抗体的抗癌药物能够主动靶向肿瘤组织。具有肿瘤特异性受体的纳米抗体可以作为将毒素或药物运送到肿瘤部位的载体，实现药物或毒素的靶向释放，减少对正常细胞的损伤，减少副作用。

B. 纳米抗体-药物偶联物 (NDC)

抗体药物偶联物 (ADC)将小分子药物的强效杀伤作用与 mAb 的高度靶向性相结合。 mAb 的大尺寸 (~150 kDa) 和 Fc 区的存在有助于改善 mAb 的药代动力学特性，但也会影响其组织渗透能力。纳米抗体（Nb）作为新型的更小、高选择性的抗体衍生物或片段，由于开发下一代靶向药物缀合物而受到广泛关注。纳米抗体药物偶联物 (NDC) 比较大的 ADC 具有优势，因为它们提供快速的全身清除、增强的稳定性和增加的肿瘤渗透率。

C. 基于纳米抗体的 CAR-T 细胞疗法

通常，单克隆抗体的单链可变片段（scFv）被用作CAR的抗原靶向结构域。然而，使用scFv作为CAR靶向结构域有一些局限性。近年来，研究人员一直关注其他类型的 CAR 结构域，包括纳米抗体、肽或配体。其中，纳米抗体作为替代的CAR靶向结构域显示出优势，包括纳米抗体的低免疫原性、高稳定性、强特异性和高亲和力，以及简单可行的开发过程。许多研究结果证实，基于纳米抗体的 CAR-T 在临床前和临床环境中都可以发挥与基于 scFv 的 CAR-T 相同的功能。

抗体结构介绍

介绍

抗体，也称为免疫球蛋白 (Ig)，于 1890 年被描述，是一种大型 Y 形糖蛋白，免疫系统使用它来识别和中和外来抗原，例如细菌或病毒。抗体几乎能够结合任何非自身表面，具有精细的特异性和高亲和力。这些属性使抗体不仅是免疫的关键，而且是生物医学研究、诊断和治疗的工具。

抗体结构

抗体由两条重链和两条轻链组成。根据多肽序列的微小差异，轻链分为 kappa (κ) 或 lambda (λ) 链。重链定义了抗体的类别或同种型。每条组分链包含一个 NH2 末端可变结构域和一个或多个 COOH 末端恒定结构域。每个可变域或恒定域由大约 110-130 个氨基酸组成。两条轻链仅包含一个恒定结构域，而重链则包含三个或四个恒定结构域，这定义了同种型。具有三个恒定结构域的重链往往包括第一恒定结构域和第二恒定结构域之间的间隔铰链区。典型的轻链的质量约为 25 kDa，三恒定结构域重链及其铰链的质量约为 55 kDa。

F(ab) 和 Fc 片段

所有抗体均含有 2 个 F(ab) 区和 1 个 Fc 区。 F(ab) 区对应于抗体分子的两个相同的臂，其包含与重链的可变域和第一恒定域配对的完整轻链。 Fc区对应于重链的恒定结构域，不包括第一恒定结构域。这三个区域通常称为片段，可以通过蛋白水解酶消化来分离。用木瓜蛋白酶消化将抗体切割成三个片段，即两个 F(ab) 片段和一个 Fc 片段，而胃蛋白酶不会分离两个 F(ab) 片段，从而产生一个 Fc 片段和一个 F(ab')2 片段由通过二硫键连接的两个 F(ab) 片段组成。F(ab) 和 F(ab')2 片段即使在消化后仍保留结合抗原的能力，这使其成为某些免疫化学技术和实验应用的理想选择。

如何选择正确的二抗？

二级抗体用于几种免疫分析中，以检测一级抗体的存在。这些抗体与酶、生物分子或荧光染料结合，以检测一抗。与一级抗体不同，二级抗体是针对一级抗体的种类和同种型产生的，通过在多个位置与一级抗体结合来检测一级抗体。

为了成功选择您的第二抗体，您应该考虑以下因素:

确保匹配良好–宿主物种是产生第二抗体的动物，应始终与第一抗体的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中产生的一抗，您将需要在不同于兔子的物种（如山羊、驴或小鼠）中产生的抗兔二抗（图1）。

完整抗体还是片段？–实际上，真正的问题应该是“您的主要抗体是单克隆抗体还是多克隆抗体？”这两个问题的答案通常取决于应用程序。单克隆一抗包含单一同种型的免疫球蛋白。因此，使用特异性识别同种型的二抗至关重要。此外，单克隆动物通常饲养在小鼠、兔和大鼠中。因此，如果主要单克隆抗体是小鼠IgG1，您将需要抗小鼠IgG或特异性较低的F（ab）片段抗小鼠IgG。抗体片段适合用于免疫组织化学和免疫荧光，因为它们的体积较小，能够穿透组织。然而，较小的大小可能会限制与片段结合的染料或酶的选择，导致二抗可能不如全抗体敏感。

多克隆一抗包含几种同种型免疫球蛋白g的混合物。因此，为了最大限度地检测目标，最好使用能识别所有同种型的二抗。多克隆抗体通常以全抗体形式（重链+轻链）饲养在兔、山羊、绵羊和驴中，因此第二宿主物种必须用来自不同物种的IgG池进行免疫，从而使纯化的第二抗体能够识别所有形式。例如，如果初级多克隆抗体是山羊IgG，您将需要抗山羊IgG（H+L）。然而，全抗体可能导致高背景和较低的特异性，因为所有免疫球蛋白共享轻链，这增加了交叉反应性（图2）。

根据您的应用选择共轭物-这取决于第二抗体如何检测信号。例如，免疫组织化学、ELISA和蛋白质印迹应用使用基于生物素标记的比色和化学发光检测来放大信号和提高灵敏度，以及与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）作用的酶反应。然而，对于免疫标记、荧光显微镜和流式细胞仪实验，使用荧光染料如Alexa Fluor检测信号，这些荧光染料直接与抗体结合以放大信号和灵敏度。

亲和纯化抗体与交叉吸附抗体–该步骤用于提高抗体的特异性，并可在亲和纯化和交叉吸附中进行区分。大多数二抗通过亲和层析纯化，产生高亲和力抗体。这种抗体通常在IHC使用，因为它们产生最小的非特异性结合，也用于蛋白质印迹检测低丰度蛋白。交叉吸附的第二抗体通常经过额外的纯化步骤，以过滤掉与非靶免疫球蛋白种类结合的成员。这一步骤增加了它们的特异性并减少了非特异性背景。这些抗体是为免疫组织化学等特殊应用而设计的。

总之，二级抗体的选择取决于手头的应用和目标丰度所需的灵敏度和纯化水平以及非特异性结合的风险。

BMA是BMA Biomedicals的缩写，是一家位于瑞士北部巴塞尔地区的小型生物技术公司。

由一群免疫学家、生物化学家和生物学家于1989年创建，其主要活动领域是抗体的开发、生产和营销。2005年，BMA被Chemoforma Inc .收购，chemo forma Inc .是一家长期活跃于免疫支持饲料添加剂生产领域的商业合作伙伴。2013年，Chemoforma Inc .收购了总部位于加州的半岛实验室国际公司，该公司专门从事抗肽抗体和放射免疫分析。

BMA的主要专长在于抗体在免疫组织化学和酶免疫分析（ELISAs）中的应用。生产已适应无胎牛血清的培养基。这不仅是对可持续发展和动物福利的重要贡献，而且产品不含污染性牛抗体。它们通常仅供体外研究使用，但支持将适当的产品给诊断领域的公司。

BMA经营自己的设施，拥有先进的分析和生产基础设施。我们的技术诀窍在于单克隆和多克隆抗体的生产和衍生，以及它们在免疫学技术中的应用。BMA还许可外部组织的产品。这些产品可能处于早期开发阶段，最终将由公司进行生产更新。

BMA的产品范围以客户为导向，包括许多专注于有限或专业应用的产品。有些是由BMA自己生产的，有些是有大量出版记录的常规产品。

BMA的产品重点包括以下领域

• 炎症和传染病
• 止血
• 肿瘤相关疾病
• 兽医试剂，特别是抗猪组织的抗体