如何选择正确的二抗？
确保匹配良好–宿主物种是产生第二抗体的动物，应始终与第一抗体的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中产生的一抗，您将需要在不同于兔子的物种（如山羊、驴或小鼠）中产生的抗兔二抗（图1）。
完整抗体还是片段？
多克隆一抗包含几种同种型免疫球蛋白g的混合物。因此，为了最大限度地检测目标，最好使用能识别所有同种型的二抗。多克隆抗体通常以全抗体形式（重链+轻链）饲养在兔、山羊、绵羊和驴中，因此第二宿主物种必须用来自不同物种的IgG池进行免疫，从而使纯化的第二抗体能够识别所有形式。例如，如果初级多克隆抗体是山羊IgG，您将需要抗山羊IgG（H+L）。然而，全抗体可能导致高背景和较低的特异性，因为所有免疫球蛋白共享轻链，这增加了交叉反应性（图2）。
根据您的应用选择共轭物
亲和纯化抗体与交叉吸附抗体
总之，二级抗体的选择取决于手头的应用和目标丰度所需的灵敏度和纯化水平以及非特异性结合的风险。
大鼠dickkopf（DKK1）酶联免疫检测试剂盒简介
用 途：用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中dickkopf（DKK1）测定。
工作原理
本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中大鼠dickkopf（DKK1）水平。向预先包被了大鼠dickkopf（DKK1）单克隆抗体的酶标孔中加入大鼠dickkopf（DKK1），温育；温育后，加入生物素标记的抗DKK1抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠dickkopf（DKK1）的浓度呈正相关。
试剂盒组成
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试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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说明书 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片（48） |
2片（96） |
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密封袋 |
1个 |
1个 |
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酶标包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
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标准品24μg/L |
0.5ml×1瓶 |
0.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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标准品稀释液 |
3ml×1瓶 |
6ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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链霉亲和素-HRP |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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生物素标记的抗DKK1抗体 |
0.5ml×1瓶 |
1 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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终止液 |
3ml×1瓶 |
6ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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浓缩洗涤液 |
（20ml×20倍）×1瓶 |
（20ml×30倍）×1瓶 |
2-8℃保存 |
需要而未提供的试剂和器材
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 精密移液器及一次性吸头
4． 蒸馏水，
5． 一次性试管
6． 吸水纸
注意事项
1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差
3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
5． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
6． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中
标本要求
1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
操作程序
1. 标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)
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12μg/L |
5号标准品 |
120μl的原倍标准品加入120μl标准品稀释液 |
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6μg/L |
4号标准品 |
120μl的5号标准品加入120μl标准品稀释液 |
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3μg/L |
3号标准品 |
120μl的4号标准品加入120μl标准品稀释液 |
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1.5μg/L |
2号标准品 |
120μl的3号标准品加入120μl标准品稀释液 |
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0.75μg/L |
1号标准品 |
120μl的2号标准品加入120μl标准品稀释液 |
2. 根据代测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3. 加样：1）空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗DKK1抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3）代测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗DKK1抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
7. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
8. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
9. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。
操作程序总结：
1.准备试剂，样品和标准品
2.加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟
3.洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟
4.加入终止液
5.10分钟内读OD值
6.计算
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批间应分别小于9%和15%
检测范围：
检测范围：0.5μg/L –13μg/L
保存条件及有效期：
保存：2-8℃。
有效期：6个月(2-8℃)。
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品牌：Cosmo Bio
CAS No.： 储存条件：室温 纯度：– |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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KYD-S018 |
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小胶质细胞研究的前沿 —从基础到临床—
京都药科大学综合药科学院
高田 和幸
◆前言
小胶质细胞是位于中枢（脑/脊髓）的组织巨噬细胞，在中枢系统位居免疫第一线。随着发育方式和生态特殊性的不断阐明，小胶质细胞备受各个学科领域的研究人员的关注，对小胶质细胞生物学的学术研究日益活跃。本文着眼于小胶质细胞的发育起源及其生态，并介绍其与脑疾病的相关性以及作为治疗靶点的地位。
◆小胶质细胞的发育
1919年，西班牙神经科学家Pío del Río Hortega生动地描述了仅次于神经细胞和星形胶质细胞的第三位大脑组成细胞群的形态学特征，并将该细胞群命名为小胶质细胞。Hortega还涉及到了小胶质细胞的发育起源，指出前体细胞是在大脑发育初期从大脑外部移入的。长期以来，其前体细胞被认为是外周血中的单核细胞，但十年前小鼠实验中利用胚外组织卵黄囊造血，发现产生的是“原始巨噬细胞”1)。该原始巨噬细胞是从被称为erythro-myeloid progenitor（EMPs）的细胞，不依赖于转录因子Myb2) ，不经过单核细胞生成的，遍及包括大脑在内的全身各个器官，暂时性形成组织巨噬细胞（图）。之后，EMPs转移至胎肝，继承了造血的场所后，此时在EMPs中产生Myb依赖性单核细胞（fetalliver monocytes）。这些单核细胞遍及全身，将先前已植入的原始巨噬细胞取代或与之共存，作为新的组织巨噬细胞形成种群3）。此时，大脑中已经形成发育阶段的血脑屏障，几乎不会被入侵。也就是说，在全身器官中存在常在性组织巨噬细胞时，只有小胶质细胞把在卵黄囊中产生的原始巨噬细胞作为主要的发育起源。
◆根据细胞起源赋予小胶质细胞的特点
由于EMPs延缓造血，在胚胎期的主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-me-sonephros : AGM）区域中形成造血干细胞（hematopoietic stem cells HSC）（图）。HSCs也在小鼠胎肝中开始胎儿期的二次造血，但在出生前不久会转移至骨髓，全面担任出生后的二次造血。HSCs来源的单核细胞也被认为是组织巨噬细胞的来源之一，但在生理条件下，它对小胶质细胞种群几乎没有任何贡献1,4）。另外，HSCs来源单核细胞随血液循环全身，响应感染和受损信号并转移至组织，分化成巨噬细胞。这些HSCs单核细胞来源的巨噬细胞生命短暂，并且会在组织中暂时性停留引起炎症反应，而EMPs来源的组织常在性巨噬细胞主要作用于营养和组织重塑。此外，HSCs来源巨噬细胞高表达趋化因子受体CCR2，EMPs来源巨噬细胞高表达F4 / 80、colony-stimulating factor-1 receptor（CSF-1R）和分形碱受体CX3CR1，不同的基因表达模式中都深刻地残留了细胞起源4)，估计与功能角色划分相关。CSF-1R介导的信号诱导microRNA-21，抑制炎症因子的表达并促进营养因子的表达5）；这在以小胶质细胞为代表的EMPs来源组织巨噬细胞的细胞起源伴随的功能特征的说明上来说也让人十分感兴趣。最近有研究推测，存在于与脑实质成为边界的血管周围间隙、硬脑膜和脉络丛中的巨噬细胞（border-associated macrophages : BAMs）和实质小胶质细胞，不仅与卵黄囊EMPs的细胞起源相同，而且在卵黄囊存在的时刻就已经决定了各自的命运6），并且还明确了BAMs与小胶质细胞的基因表达模式的区别7)。如此一来，小胶质细胞这一组织巨噬细胞在特点上，就不仅可以从植入目的地中的大脑和脊髓这样的环境中接收信号，还可以很大程度地反映从其独特的发育起源受到的影响。所以想要更深入并且更准确地理解小胶质细胞的生态和功能的话，就必须充分考虑其发育起源。
◆维持小胶质细胞种群
如上所述，小胶质前体细胞仅在胎儿期产生，出生后由骨髓HSCs来源单核细胞几乎很少参与小胶质细胞的补充。关于维持该小胶质细胞出生后的种群数，近年的报告显示，在小鼠大脑中的所有小胶质细胞以约96天为周期发生周期性交换，重复细胞死亡（凋亡）和分裂的过程，来稳定脑内的细胞数量8)。这种利用自我分裂来维持种群的模式，以表观遗传修饰的形式，分裂后的细胞也传达发育起源。此外，不时还会继承植入后在中枢内时刻发生变化的微环境的信息，估计与时空依赖性的小胶质细胞亚群和脑疾病中特异性亚群的出现密切相关9,10)。
◆小胶质细胞与脑疾病
21号染色体三体引发的Down syndrome（DS），在胎儿期神经发生减少的原因至今尚未阐明。在与京都药科大学的石原庆一博士等人的共同研究中，分析DS模型小鼠时发现，在胎儿期的大脑中，包含小胶质细胞在内的脑组织巨噬细胞的比例减少，中性粒细胞以及单核细胞等炎症细胞的比例增加，由此看出大脑皮层中神经新生降低11）（图）。 结果表明，包含小胶质细胞在内，在胎儿期的大脑免疫环境的破绽与DS的病发密切相关，其正常化将是DS胎内治疗法中新的治疗目标。
另一方面，Alzheimer’s disease（AD）的最大风险因素就是年龄衰老，发病前几十年间在大脑中积蓄的淀粉样蛋白-β(Aβ)被当做是病态形成的诱因。而且很久以前我们就知道小胶质细胞会在Aβ聚集部位（老年斑）积蓄。考虑到小胶质细胞通过自我分裂来维持种群的机构，或许年龄衰老、Aβ长时间暴露等积累的小胶质细胞性质的变化，正是连接从Aβ到AD发病的主要途径。我们从小鼠骨髓和外周血中收集HSCs，在CSF-1的刺激下制备巨噬细胞，将其移植至可呈现脑内Aβ积蓄的AD小鼠模型的海马体中，发现小鼠的认知功能障碍得到了改善13,14)（图）。最初认为是只有移植的巨噬细胞的Aβ吞噬带来了治疗效果的作用机制，但结果发现，是该移植细胞分泌的transforming growth factor-β1（TGF-β1）引起的小胶质细胞的功能变化也与治疗相关15)。有报告称TGF-β信号在发育初期阶段中，从原始巨噬细胞转变为小胶质细胞的命运是必须的6)。另一方面还有报告称，去除包含小胶质细胞在内的老化胶质细胞与改善认知功能相关16)。由于Aβ长期暴露和年龄衰老的累积，导致小胶质细胞的性质改变降低认知功能，小胶质细胞发育初期所须的TGF-β信号会抵消部分变化，这或许与改善认知功能相关。
◆结语
在小胶质细胞通过重复自我分裂来维持种群的机构中，遗传其发育起源和植入后的微环境信息以表观遗传修饰的形式继承，从而获得小胶质细胞时空依赖性的特点。我们在与Agency for Science, Technology and Research（A*STAR）的 Florent Ginhoux博士的共同研究中，已成功从多能诱导干细胞（iPS）细胞中制备可反映胎儿早期造血的原始巨噬细胞（iMacs）17)（图）。像这样使用原始细胞再现发育起源的分析，有望引导我们进一步正确的理解小胶质细胞的生态。为研究大脑从发育到衰老各阶段引起的脑疾病发病机制，为了获取开发治疗发的线索，有必要正确地了解小胶质细胞发育、成熟和衰老等阶段。将巨噬细胞移植至AD模型小鼠的研究是与札幌医科大学的下滨俊教授、京都药科大学的芦原英司教授、立命馆大学的北村佳久教授的共同研究。
图. 包含小胶质细胞在内的组织巨噬细胞的发育与脑疾病的关联
在小鼠卵囊中，EMPs不经过转录因子Myb非依赖性单核细胞生成原始Mφ，并作为包含小胶质细胞的Mφ组织植入至各组织中。小胶质细胞和去往BAMs的方向在此时确定，小胶质细胞的分化需要TGF-β信号。其他原始Mφ的方向尚未明确。之后，向胎肝移动的EMPs生成胎肝单核细胞，一边替换原始φ或与原始φ共存，一边形成新组织Mφ，但由于中枢中存在血脑屏障而未被替换。随后，在AGM区域产生的HSCs来源单核细胞，在生理条件下也不会变成小胶质细胞，而是响应感染/受损信号，从血液中转移至组织成为Mφ。小胶质细胞的发育起源是卵黄囊的原始Mφ，之后通过细胞死亡和自我分裂维持种群。在DS模型小鼠胎儿期的大脑内，小胶质细胞和BAMs的比例减少，炎症细胞的比例增加，神经发育降低11)。将通过CSF-1刺激的HSCs制备的Mφ移植至AD模型小鼠中后，移植细胞不仅会吞噬Aβ，还会分泌TGF-β1促进内源性小胶质细胞的Aβ吞噬，从而改善认知功能障碍13-15)。
左图： 再现iPS细胞来源Mφ(iMacs)是原始Mφ的发育过程，可分化诱导小胶质细胞，显示Aβ吞噬功能。（Scale bars:20 μm）
右图：成年小鼠海马体的小胶质细胞（经过Goat抗Iba1抗体染色）。（Scale bars:20 μm）
Aβ: amyloid- β , AD: Alzheimer’s disease,
AGM: aorta-gonad-mesonephros,
BAMs: border-associates macrophages,
CSF-1: colony-stimulating factor -1,
DS: Down syndrome,
EMPs: erythro-myelord progenitors,
HSCs: hematopoietic stem cells,
Mφ: macrophages ,
TGF-β: transforming growth factor-β。
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◆参考文献
1） Ginhoux, F. et al. : Science, 330, 841（2010）.
2） Schulz, C. et al. : Science, 336, 86（2012）.
3） Hoeffel, G. et al. : Immunity, 42, 665（2015）.
4） Hagemeyer, N. et al. : EMBO J., 35, 1730（2016）.
5） Caescu, C. I. et al. : Blood, 125, e1（2015）.
6） Utz, S. G. et al. : Cell, 181, 557（2020）.
7） Mrdjen, D. et al. : Immunity, 48, 380（2018）.
8） Askew, K. et al. : Cell Rep., 18, 391（2017）.
9） Masuda, T. et al. : Nature, 566, 388（2019）.
10） Keren-Shaul, H. et al. : Cell, 169, 1276（2017）.
11） Ishihara, K. et al. : Brain Pathol., 30, 75（2020）.
12） Baik, S. H. et al. : Cell Metab., 30, 493（2019）.
13） Kawanishi, S. et al. : J. Alzheimers Dis., 64, 563（2018）.
14） Kuroda, E. et al. : J. Alzheimers Dis., 73, 413（2020）.
15） Kuroda, E. et al. : Neuroscience, 438, 217（2020）.
16） Tyler, B. et al. : Nature, 502, 578（2018）.
17） Takata, K. et al. : Immunity, 47, 183（2017）.
细胞破碎设备和技术综述
珠磨均质机
底部驱动实验室转子-定子均质机是实验室的新成员。转子-定子组件通常放置在密封的腔室或容器内，适合搅拌机电机底座，工作容积为100-1000毫升。
分散器
与转子-定子均质器密切相关，分散器用于制备大量植物和动物水提物。转子-定子机构的构造类似于家庭垃圾处理装置，可快速均匀化和液化千克数量的生物质。样品悬浮在一升或多升介质中，装入顶部容器中，以连续或分批模式均质化。
现代超声波处理器使用由锆钛酸铅晶体制成的压电发生器。振动通过钛金属喇叭或探针传递，该喇叭或探针被调整为使处理器单元以15-25 kHz的频率共振。超声波处理器的额定功率输出从10瓦到375瓦不等。真正重要的是探针的功率密度。正如预期的那样，需要更高的输出功率来维持大尺寸探头的良好性能。对于细胞破碎，探针密度应至少为100 W/cm2，并且振动幅度越大越好（典型范围:30-250微米）。