日度归档：2024年4月21日

如何测量纳米/微球的 CV 值并揭示实际尺寸分布？

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如何测量纳米/微球的 CV 值并揭示实际尺寸分布？

在尺寸表征领域，主要有扫描/透射/扫描透射电镜（SEM/TEM/STEM）和动态光散射（即DLS）两种方法。不幸的是，我们发现与 SEM/TEM/STEM 技术相比，DLS 不适合准确确定纳米/微球的尺寸分布。 
 

  • DLS 结果与胶体稳定性密切相关，不可避免地会导致大尺寸纳米粒子的尺寸分布不准确。对于低于 100 nm 的纳米粒子，流体动力学尺寸变得相关。然而，对于几百纳米左右或以上的纳米粒子，胶体稳定性受重力作用的影响很大。相比之下，SEM/TEM/STEM 图像仅基于干燥样品，在我们的案例和文献中通过大量研究已经看到更高的再现性和可靠性。

  • DLS 无法区分纳米粒子本身和表面活性剂的聚集体。由于我们的大多数胶体纳米/微球都在系统中故意添加了痕量表面活性剂以延长使用寿命，因此 DLS 变得不适合直接尺寸测量，除非纳米/微球用 Milli-Q 水或去离子水至少洗涤 3 次- 离子水以去除表面活性剂的任何痕迹。同样，由于重新悬浮效率低下而导致的纳米/微球也会扭曲 DLS 结果；例如，在 DLS 测量下，几个聚集的 100 nm 纳米粒子可能被视为 200 nm 或 300 nm 纳米粒子。

  • DLS 无法深入了解 纳米/微球的形状或球度。在 DLS 测量下，不规则形状的颗粒和球形颗粒可以得到 相同的解释。

 

因此，我们使用 SEM/TEM/STEM 技术代替 DLS 测量作为我们的常规质量控制方法。我们通常会拍摄至少 10 张电子显微照片，并使用 ImageJ 处理它们以获得尺寸分布和 CV 值。这也是我们通常在向客户交付产品时随附几张具有代表性的 SEM/TEM/STEM 图片的原因。我们希望揭示真实的尺寸分布，让客户直接可视化纳米/微球的图像，而不是间接查看拟合曲线。 

使用荧光核酸染色剂 LUCS 13 对活细胞进行染色

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使用荧光核酸染色剂 LUCS 13 对活细胞进行染色

LUCS 13 是一种可渗透细胞的核酸染料，在与核酸结合后呈现绿色荧光。该染料具有高荧光产量，且结构与 SYTO™13 染料相同。

LUCS 13 用于对活的和死的真核细胞以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的 DNA 和 RNA 进行染色。染料被 488 nm 的蓝色激光激发。其荧光发射在荧光素通道中检测到，与 DNA 结合时峰值为 509 nm，与 RNA 结合时峰值为 514 nm。

该染料可用于同时标记细胞不可渗透的核标记物（例如 YoDi-3），以使用荧光显微镜和流式细胞术评估细胞活力。

协议

确切的方案取决于具体的细胞类型和实验任务。一般来说，可以描述如下：

  1. 准备 50 µM LUCS 13 储备溶液。为此，将 990 µl 去离子水添加到 10 µl 5 mM LUCS 13 溶液中。储备液可以等分并冷冻以供长期储存。

  2. 要制备 1 µM LUCS 13 工作溶液，请将 20 µl 50 µM LUCS13 库存添加到 980 µl PBS 中。

  3. 以合适的方式小心地从生长表面去除贴壁细胞。对于悬浮细胞，从下一点开始工作。

  4. 用冷 PBS（pH 7.4）清洗细胞一次。 300 g离心 5 分钟获得种子细胞 。

  5. 将细胞在 1 ml 1 μM LUCS 13 工作溶液中于 37°C 孵育 30 分钟。

  6. 300 g离心 5 分钟去除染料溶液 。

  7. 用 PBS 清洗细胞一次。

  8. （可选）如有必要，可以将细胞在含 3.7% 甲醛的 PBS 中固定 15 分钟，用 PBS 洗涤，然后用另一种染色剂重新染色。

重要的

  • 处理 LUCS 13 溶液时请使用塑料瓶，因为稀释的染料可能会粘在玻璃上。

  • 使用无磷酸盐缓冲液（例如盐水中的 15 mM HEPES）可获得更明亮的染色结果。

  • 在开始实验之前，测试几种染料浓度范围从 10 nM 到 5 µM，以确定最佳的染料稀释度。染色结果受许多因素影响：生长培养基、细胞密度、其他细胞类型的存在、染色持续时间等。

Nanogold® 偶联物分离方法

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Nanogold® 偶联物分离方法

将凝胶过滤作为分离 Nanogold® 结合物的方法：这是我们实验室的常规使用方法，并且该方法已得到很好的表征。 Nanogold® 的分子量接近 15,000，但由于其中很大一部分是由非常致密的金原子组成的，因此在许多基于大小的分离技术（例如凝胶过滤）中，Nanogold 的表现就好像其 MW 更接近大约 8,000。

在计划您的标记反应时，您应该使用过量的成分，根据尺寸更容易与 Nanogold® 标记的产品分离。如果您的分子小于 Nanogold®，您应该使用过量的较小分子进行标记反应（对于稍小的分子，大约 5 倍过量是一个很好的起点，对于小得多的分子，10 倍到 20 倍是一个很好的起点分子），因为从反应混合物中分离过量的小分子比分离过量的大分子更容易。

如果您要标记大于约 10,000 MW 的分子，您应该使用过量的 Nanogold®，因为现在它比过量的未反应生物分子更容易与偶联物分离。对于大多数反应，两倍到五倍的过量是合适的。

凝胶过滤介质及其分离特性的列表在我们的 偶联物分离指南.

已经尝试了其他色谱方法，但迄今为止尚未给出可重现的结果。一种对十金有一定成功的方法是疏水相互作用色谱法，这种方法对十®金来说似乎很有希望。该方法的优点是可用于从纳米金偶联物中分离较大和较小的杂质;pocedure基于Hainfeld描述的undecagold，undecagold-Fab'共轭物和unlabelfab'的分离：

应该注意的是，使用的技术是疏水作用色谱，而不是反相;该方法依赖于离子强度递减的梯度，其中不同的固定化分子以不同的离子强度脱落。对于十一金和纳米金实验，都使用了丁基衍生化凝胶;还尝试了联苯衍生化凝胶，但丁基凝胶给出的结果最好。

使用三到六柱体积的梯度进行分离。将偶联物溶解在2.0 M硫酸铵中，使用乙酸三乙基铵（5 mM）将pH调节至中性值（7或7.5）。用于梯度的两个缓冲区是： （A）2M硫酸铵，使用三乙基乙酸铵（5mM）将pH调节至中性值（6.5，7或7.5）。 （B） 5 mM 三乙基乙酸铵，pH 7 或 7.5。 样品进样后，运行一体积的缓冲液A，然后在梯度上，缓冲液B的比例从0稳定增加到100%，然后用缓冲液B继续洗脱.使用该梯度，首先洗脱未偶联的Fab'，然后洗脱Nanogold-Fab'，然后是未连接的Nanogold。

我们不推荐将凝胶电泳作为纯化方法，因为 Nanogold® 颗粒在凝胶中的迁移是不可预测的，并且结合物的鉴定并不简单。透析的结果好坏参半；然而，应谨慎行事，因为某些膜含有可降解 Nanogold® 的成分。

 

使用 LumiZol 试剂快速分离 RNA、DNA 和蛋白质

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使用 LumiZol 试剂快速分离 RNA、DNA 和蛋白质

LumiZol Reagent 设计用于从各种来源（植物、动物、细菌和酵母）的细胞和组织样品中快速分离 RNA、DNA 和蛋白质。 LumiZol Reagent 是一种含有苯酚、异硫氰酸胍以及分离高质量核酸和蛋白质所需的其他成分的溶液。苯酚和异硫氰酸胍可裂解细胞并有效抑制核糖核酸酶，从而保持 RNA 完整。均质化并添加氯仿后，样品分离成上层水相、中间相和下层有机相。 RNA 可以用异丙醇从上相沉淀，而 DNA 和蛋白质可以分别用乙醇和异丙醇从中间相和下层有机相沉淀。

用于 RNA、DNA 和蛋白质分离的样品：

  • 植物和动物组织——30-100毫克；

  • 贴壁真核细胞 — 1×10 5至 1×10<sup7< sup=”” style=”box-sizing: border-box;”>;

  • 悬浮真核细胞、酵母 — 5×10 6至 10×10 6；

  • 细菌细胞 — 1×10 7。

RNA分离

使用新鲜或液氮速冻样品以获得最佳 RNA 分离效果。在 LumiZol 试剂中均质化之前，请勿解冻样品。

  1. 根据您的起始材料在 LumiZol 试剂中裂解样品：

    • 组织：在 1 mL LumiZol 试剂中匀浆组织样本，并将匀浆转移至新的 1.5 mL 管中。

    • 细胞：弃去培养基，用 0.5–1 mL LumiZol 试剂重悬细胞沉淀或单层细胞，然后将裂解物转移至新的 1.5 mL 试管中。

  2. （可选）如果样品脂肪含量高，则将裂解液在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，然后将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。

  3. 将管在室温下孵育 5 分钟。

  4. 向裂解液中添加 0.2 mL 氯仿（每 1 mL 用于裂解的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并在室温下孵育 2 分钟。

  5. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。离心后，混合物分成两相：无色水相和黄色有机相，其间有中间相。

  6. 将上层水相转移至新的 1.5 mL 管中，不要接触间相。如果样品中RNA的量非常少，则在水相中添加共沉淀剂。保留有机相和界面用于 DNA 和蛋白质提取。

  7. 向水相中加入0.8体积的异丙醇，充分混合，并在室温下孵育10分钟。

  8. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。

  9. 弃去上清液，向 RNA 沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇，充分混匀，并在 4 °C 下以 7,500 × g离心管 5 分钟。

  10. 弃去上清液，将 RNA 沉淀风干 5-10 分钟。

  11. 将 RNA 沉淀溶解在 50–100 μL 无 RNase 水中。

DNA分离

  1. 除去“RNA 分离”部分步骤 5 中获得的界面上的任何剩余水相。

  2. 向界面相和有机相中添加 0.3 mL 100% 乙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管混合，并在室温下孵育 2-3 分钟。

  3. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。上清液可用于后续的蛋白质提取。

  4. 将 DNA 沉淀重悬于 1 mL 柠檬酸钠/乙醇溶液（10% 乙醇中的 0.1 M 柠檬酸钠，pH 8.5）中。

  5. 孵育 30 分钟，偶尔混合。

  6. 将管在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  7. 再重复一次步骤 4-6。

  8. 将 1 mL 70% 乙醇添加到 DNA 沉淀中，充分混匀，然后在 4 °C 下以 2,000 × g离心管 5 分钟。

  9. 弃去上清液，将 DNA 沉淀风干 5-10 分钟。

  10. 将 DNA 沉淀重悬于 0.3–0.6 mL 的 8 mM 氢氧化钠中。

  11. 将管在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，并用 Tris-HCl 缓冲液将 pH 调节至 7–8 [添加 5 μL 1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 4.5）至300μL DNA溶液]。

蛋白质分离

  1. 向《DNA 分离》部分第 3 步获得的上清液中添加 1.5 mL 异丙醇（每 1 mL 《RNA 分离》步骤 1 中使用的 LumiZol 试剂），通过翻转管充分混合，并孵育 10分钟在室温下。

  2. 将管在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。丢弃上清液。

  3. 将蛋白质沉淀重新悬浮在 2 mL 盐酸胍/乙醇溶液（0.3 M 盐酸胍于 95% 乙醇中）中。

  4. 将管在室温下孵育 20 分钟。

  5. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  6. 再重复步骤 3-5 两次。

  7. 向蛋白沉淀中加入 2 mL 100% 乙醇，充分混匀，室温孵育 20 分钟。

  8. 将管在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。

  9. 将蛋白质沉淀风干 5-10 分钟。

  10. 将蛋白质沉淀溶解在含有 SDS 的缓冲液中（例如，用于将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上的样品缓冲液）。