OrigamiB(DE3) Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

货号： MF2346-1000UL 品牌： Jinpan 标签： 分子生物学

描述

OrigamiB(DE3) Chemically Competent Cell

大肠杆菌化学感受态细胞

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产品组分：

菌株描述

OrigamiB菌株与原始菌Origami一样，包含突变的硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin Reductase, trxB）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,gor），表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。该菌株包含BL21的lon和ompT缺失，能提高蛋白稳定性。

DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因）。这种菌株适用于目的基因克隆在pET载体上的蛋白生产，由IPTG诱导表达。

OrigamiB(DE3)菌株具有卡那霉素和四环素抗性，因此不适合与仅能用卡那霉素或四环素筛选的质粒联用。

OrigamiB(DE3)菌株基因型：F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522:: Tn10 trxB (KanR, TetR)

产品描述

本品是大肠杆菌OrigamiB(DE3)菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，6个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1. 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。
2. 最好在冰上融化感受态细胞。
3. 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。
4. 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。
5. 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。
6. OrigamiB(DE3)菌株具有卡那霉素和四环素抗性，不能用于具此抗性质粒的表达。
7. 诱导时，IPTG浓度范围可选：0.1~2mM。
8. 为了得到足量的蛋白，需就最佳诱导时间、温度、IPTG浓度进行优化。
9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1. 从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA，用手轻弹管底轻轻混匀，冰浴静置25min。
2. 42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。
3. 向每个离心管中加700 μl无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
4. 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到所选质粒筛选抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养过夜。

   【注意】：

   a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

   b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

   c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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附录I 蛋白诱导步骤（仅作参考）

1）从新鲜涂布平板上挑取一单克隆，转移到含相应抗生素的3ml LB液体培养基内。

2）37℃，200rpm摇菌培养过液。

3）将步骤2）中过夜培养的菌液吸取0.5ml接种到含相应抗生素的50ml LB液体培养基内（建议使用500ml三角瓶培养）。

4）37℃，150rpm摇菌培养直至OD600达到0.6~0.8（建议0.6，约2.5h）。

5）【可选】用移液枪吸取1ml培养物到干净的离心管内，置于冰上直至用于凝胶分析或保存在-20℃。这是非诱导的对照样本。

5）加入IPTG使其终浓度为1mM。目的蛋白的最佳诱导时间可能在2~16h，依蛋白而异。

6）37℃，120rpm培养2~4h。为了确定目的蛋白的最佳诱导时间，建议作一个时间周期优化实验，范围从2~16h。

7）将培养物冰浴10min。4℃，5,000 x g离心10min收集菌株。

8）吸掉上清，将沉淀保存在-20℃（也能保存在更低的温度）。

IPTG母液（1M）配制

称量2.38g IPTG（Mw: 238.30）溶于适量去离子水，充分溶解后，调整终体积到10ml，并过滤除菌，即得到1M ITPG母液。

规格信息