IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

货号： MF2002-100G 品牌： Jinpan 标签： 分子生物学

描述

IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

产品关键词：

IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；X-gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷；β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）；lac repressor乳糖阻遏物；lacZ Operon lacZ操纵子；Blue-white Screening蓝白斑筛选；CAS NO.: 367-93-1

基本描述:

IPTG，英文全名Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，中文全名异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，CAS NO：367-93-1，诱导细菌lac或tac操纵子调控的基因转录，尤其是水解酶β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）。一旦表达，β-gal水解β-半乳糖苷和乳糖为单糖。IPTG通常用于β-gal活性分析，当含大肠杆菌来源lacZ基因的载体转染进入细胞后，编码表达β-gal，细胞裂解后，通过催化底物ONPG的颜色反应即可定量分析活性。IPTG也是硫代半乳糖苷转乙酰基酶的底物，文献报道还能诱导合成细菌青霉素酶。体内研究IPTG的一个重要优势在于，IPTG不会大肠杆菌所代谢，IPTG浓度和lac p/o控制基因表达都保持稳定。

IPTG诱导lacZ表达的作用机制:

1）lacZ操纵子（lacZ Operon）的概念

lac操纵子是调控大肠杆菌和其他一些细菌的乳糖转运和代谢必需的一种操纵子，包含三种紧密连接的结构基因，lacZ，lacY和lacA。包括葡萄糖和乳糖等在内的几种因素都可调控lac操纵子。

2）IPTG诱导lacZ表达的作用机制

lacZ基因是β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）表达的一种基因。IPTG作为一种非代谢性的半乳糖类似物，与lac repressor（lac阻遏物，乳糖阻遏物）结合，以变构形式释放lac操作基因（lac operator）来源的四聚体阻遏物，从而允许lac操纵子上的基因转录，比如lacZ基因表达β-gal。克隆实验IPTG诱导lacZ基因表达。IPTG是最常用的lac操纵子合成诱导剂，在极低浓度有活性，且不会受酶降解的影响。

IPTG的主要生理功能:

1）β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）活性检测

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大肠杆菌lacZ基因编码，是最常用的一种报告酶，用来研究哺乳动物细胞的基因表达，蛋白-蛋白相互作用，以及标准化转染效率。

检测原理：IPTG诱导lacZ基因表达β-半乳糖苷酶（β-gal），细胞裂解后，体系中加入无色的ONPG（邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），被β-gal水解为邻硝基苯酚（o-nitrophenol），生成黄色（420nm）。颜色反应的强度与β-gal活性成正比。

2）蓝白斑筛选（Blue-white screening）

IPTG普遍用在需要诱导β-gal活性的克隆步骤中，最为常见的就是和X-gal联合使用进行蓝白斑克隆筛选，或与Magenta-gal联合使用进行红/白斑克隆筛选。

作用机理：当目的基因插入载体lacZ基因，破坏β-gal表达并阻止其表达。细菌在含X-gal的培养基上生长，β-gal水解此底物生成一不可溶蓝色产物，菌落呈蓝色。若β-gal不能表达，细菌克隆则无法催化X-gal底物，菌落呈白色，以此区分转化重组载体或非重组载体的克隆子。

3）重组蛋白的诱导表达

IPTG也可用于重组蛋白的诱导表达。在这些体系中，待研究蛋白在IPTG诱导型启动子下游编码。IPTG诱导待研究蛋白表达，对细胞裂解后，使用一系列合适方法来纯化蛋白，如His-tag或GST-tag纯化系统（融合相应标签的重组蛋白）。

IPTG产品特性

1）CAS NO：367-93-1

2）英文同义名：Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; Isopropyl β-D-thiogalactoside; IPTG;

3）中文同义名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；

4）分子式：C9H18O5S

5）  分子量：238.30 g/mol

6）  纯度：≥99%（基于干重，HPLC）

7）  外观：白色结晶粉末

8）  杂质：≤0.1% Dioxane（二氧六环）

9）  溶解性：溶于水、乙醇

10）化学结构：

使用方法

1. IPTG储存液配制

称取0.238g IPTG溶于10ml去离子水中，充分溶解混匀后，经0.22μm滤膜过滤除菌，即得到100mM（100×）的储存液。按照1ml/管分装，置于-20℃冻存，高达一年稳定。

2.蓝白斑筛选方法

方法1：X-Gal、IPTG加入固体培养基（推荐）

1）高压灭菌已加琼脂的培养基，并冷却到50℃左右；

2）每ml培养基内加入10μl 20mg/ml X-gal溶液、10μl 100mM IPTG（使其终浓度达到1mM）；

3）加入适量筛选抗生素如氨苄青霉素，卡那霉素，羧苄青霉素等；

4）混匀后倒板，置于无菌超净台内使培养基凝固（通常需要30min）。

5）将转化的感受态细胞涂布到上述平台，于37℃倒置培养过夜，观察蓝白斑情况。

方法2：X-Gal、IPTG直接涂布平板表面

1）于无菌超净台内干燥倒好的平板；

2）加120μl 20mg/ml X-gal溶液、40μl 100mM IPTG到平板表面，并涂布均匀覆盖整个平板；

3）于无菌超净台内干燥上述平板，至少需要30min；

4）将转化的感受态细胞涂布到上述平台，于37℃倒置培养过夜，观察蓝白斑情况。

方法3：X-Gal、IPTG加入上层培养基（噬菌体）

1）高压灭菌已加琼脂（0.7%）的培养基，并冷却到50℃左右；

2）每3ml培养基内加入40μl 20mg/ml X-gal溶液、25μl 100mM IPTG；

3）加入细菌和噬菌体混合物，翻转离心管使快速混匀，然后倒入上层平板铺平。

4）于30℃培养过夜，观察蓝白噬菌斑情况。

3. IPTG诱导重组蛋白的表达

细菌重组蛋白用IPTG诱导表达，有两种基本方法，一种是快速诱导法，并非适合所有蛋白，且产量并非最理想。另一种是慢诱导法，能增强一些蛋白的可溶性。根据具体要求来选择合适方法。

方法1：快速诱导法

1）从一个相对新鲜平板上挑取一个克隆，接种到含Amp的1-2ml LB培养液，装入15ml离心管，30°C (or 37°C)于摇床培养过夜；

2）按照1:50（37°C培养1:100）的比例稀释到2ml含Amp的LB培养液，装入15ml离心管，37°C于摇床培养3-4h；

3）提前准备1ml LB+Amp+1mM IPTG，装入15ml离心管内，并在使用前15min于37°C预热；

4）从步骤2中培养3-4h的培养液中吸取1ml，装入1.5ml离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C待用。【此为未诱导对照】

5）将预热的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培养物中，重新置于37°C培养3-4h；此时培养总体积2ml，IPTG终浓度未0.5mM。

6）从步骤5中培养3-4h的培养液中吸取1ml，装入1.5ml离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C冻存。【此为诱导样本】

7）SDS-PAGE检测样本：加入100ul 1X loading buffer（含1% BME）到未诱导和诱导样本中。漩涡混我10s-1min，或直至看不到细菌团。煮沸3-5min，超速离心30s。

方法2：慢速诱导法

1）—4）步骤同上；

5）将20°C的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培养物中，重新置于20°C培养12-16h；此时培养总体积2ml，IPTG终浓度未0.5mM。

6）从步骤5中培养12-16h的培养液中吸取1ml，装入1.5ml离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C冻存。【此为诱导样本】

步骤3：可溶性蛋白的提取

1）用2ml冰STE（10mM Tris，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA；）洗涤细菌沉淀物一次；

2）重悬细菌沉淀物（10ml诱导培养物），用800ul含100ug/ml溶菌酶的STE；（溶菌酶必须重悬前即刻加入）；

3）冰浴15min；

4）加入DTT（货号：JP5510-10G）使其终浓度未5mM；

5）加入蛋白酶抑制剂（货号：MP1610-1ML）。

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注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

规格信息