新型亲和法外泌体提取试剂盒

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS

 

　　MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS 采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和 Tim４蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用 10,000×g 离心后的上清。

　　该试剂盒使用含有 EDTA 的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他 EVs 可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。

 

◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法

　　Tim４蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有 EDTA 的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡。

◆优点・特色

 

 

使用新型亲和提取方法

●　通过PS亲和分子回收 ●　低背景值 ●　在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱 ※　可获得高纯度，完整的外泌体

无需进行超离

●　使用磁珠改进了操作

●　流程优化

※　高重复性

与其他提取方法相比
方法	外囊泡纯度	囊泡状态	可操作性	回收量
PS亲和法	■■■	完整	简便稳定	■■■
超速离心法	■■	完整	简便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	简便快捷	■■■■
密度梯度离心法	■■■■	完整	复杂	■■
抗体亲和法	■■■	不完整	简便稳定	■■

样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。

●　可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡

●　可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

●　重复性高，回收量稳定

●　简易操作（约3.5小时）

●　启用多个样品（无需超速离心）

◆试剂盒组成

产品名称	包装规格		保存条件
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	10次 （产品编号：293-77601）	2次 （产品编号：299-77603）	2-10°C
试剂盒成分 (1) 链霉亲和素磁珠 (2)生物素标记的外泌体捕获 (3)外泌体捕获免疫固定缓冲液 (4)外泌体结合增强剂（×500） (5)洗涤缓冲液 (6)外泌体洗脱缓冲液 (7)反应管	<10 次> 600 μL×1 管 100 μL×1 管 35 mL×1 瓶  500 μL×1 管  75 mL×2 瓶  5 mL×1 瓶  22 管	<2 次>  120 μL×1 管  20 μL×1 管  7 mL×1 瓶  100 μL×1 管  30 mL×2 瓶  1 mL×1 瓶  1 管

 *每套试剂盒能完成５次回收实验，即实际使用量为 10×5次/Kit 与 2×5次/Kit

◆案例•应用

从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析

从人血清中提取外泌体的产量比较

　　使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用 CD9 和 CD63 抗体进行免疫印迹实验。

●　检测抗体

      抗 CD9 兔多抗，System Bioscience公司

      抗 CD63 兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果相当于 150 μL 的血清样本。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

 

从人EDTA血浆中提取外泌体

　　分别从１mL 的 EDTA 血浆、EDTA 血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行 WB 检测（抗 Flotillin2 抗体）。

●　检测抗体

      抗 Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 公司

●　使用样品量

      各１mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应 150 μL 样品量。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

 

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

　　１mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗 CD9 抗体）。

●　检测抗体

      抗 CD9 兔多抗，System Biosciences 公司

●　使用样品量

      各１mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应 150 μL 尿液样品。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，加入５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

 

◆与传统沉淀法的功能比较实验

　　分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS【PS 亲和法】

　　按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1 mL经过离心处理（10,000×g，30min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）中提取外泌体。

超速离心法

　　将 10 mL 经过离心处理（10,000×g，30 min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70 min），用 TBS 缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　从 1 mL 经过离心处理（10,000×g，30 min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。

※1：110,000×g 离心２小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果

　　分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用 NanoSight LM10 检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为２%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（２~4×10¹⁰ particles），在透射电子显微镜进行分析。

电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ 可提取到很多 100 nm 左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

 

K562 细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）

　　用 PS 亲和法、超离法和聚合物沉淀法从 K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和 WB 法（CD63, Flotilin-2 和 Lamp-1 抗体）进行实验。

回收量，不是回收率

●　检测抗体

     抗 CD63 小鼠单抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠单抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

 

K562 细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10% FBS-添加培养基）

　　用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从 K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS 补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和 WB 法（CD63、Lamp-1 和 Flotilin-2 抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自 K562 细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。

●　检测抗体

     抗 CD63 小鼠单抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

     健康人血清来源的外泌体中提取 miRNA 和 mRNA 的回收量比较

实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的 microRNA 和 mRNA 的回收量

通过超离法和 PS 亲和法将 EVs 从正常人血清中分离，然后使用 microRNA 提取试剂盒（产品编号295-71701）提取 RNA。通过 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比较 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。

②运用不同的 RNA 提取方法提取 microRNA 和 mRNA 的回收量比较

　　运用 PS 亲和法将 EVs 从正常人血清中分离，然后使用 microRNA 提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于 AGPC 法的试剂提取 RNA。通过 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比较 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌体蛋白质组学分析

<实验内容及结果>

　　分别利用 PS 亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含 10% FBS（不含外泌体）的 K562 细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用 10% 聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用 LC-MS 对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过 MASS 分析鉴定的前 10 个蛋白质

白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱：来自 FBS 的牛蛋白污染物

红 色：来自外囊泡的标记蛋白

样品：K562 细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）

	PS 亲和法	超离法	聚合物沉淀法
1	71 kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)	补体C3 (Complement C3)
2	膜联蛋白A6 (Annexin A6)	铁转蛋白受体１ (Transferrin receptor protein1)	α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin)
3	铁转蛋白受体１ (Transferrin receptor protein1)	血清白蛋白 (Serum albumin)	纤连蛋白 (Fibronectin)
4	V-ATP酶A亚基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A)	ATP依赖RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A)	血清白蛋白 (Serum albumin)
5	浮舰蛋白-2 (Flotillin-2)	微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain)	血小板反应蛋白-1 (Thrombospondin-1)
6	程序性细胞死亡６互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)	71 kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71 kDa protein)	补体C4 (Complement C4)
7	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain )	脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase)	α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase)
8	膜联蛋白A1 (Annexin A1)	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain)	载脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100)
9	220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)	U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)	胎儿血红蛋白亚单位 (Hemoglobin fetal subunit beta)
10	膜联蛋白A2 (Annexin A2)	β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain)	β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain)

成对组合相关性比较

 

◆应用数据

Protein Assay BCA Kit 检测外泌体的蛋白质浓度

　　Protein Assay BCA Kit 是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质 Cu²⁺ 离子被还原为 Cu⁺。Cu⁺与 BCA 形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定 562 nm 处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过 Protein Assay BCA Kit 高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。

【实验内容及结果】

　　将通过 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的 25 μL 外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit 中试剂Ａ和试剂Ｂ混合液 200 μL。之后 60℃ 孵育 30 分钟，检测 560 nm 吸光度（图1）。结果表明，通过 Protein Assay BCA Kit 的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此 BCA 测定时不要稀释样品。

①　将 BSA 标准溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白对照，分别每孔 25 μL 加到 96 孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔 25 μL 加入 96 孔板。

③    把 200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂Ａ盒试剂Ｂ混合液（Ａ：Ｂ=50：1）加入放有样品的孔板中。

④    60℃ 孵育 30 分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定 560 nm 的吸光度

 

产品编号	产品名称	包装
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1 mL×10

 

◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验

【实验概要】

用 PKH67（Sigma公司）标记 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela 细胞导入确认。

<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从 K562 细胞培养上清液提取外泌体）。

2. 用 BCA Assay 和 NanoSight 检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度。

3. 将相当于5 μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5 mL管中。

   *请配制合适的使用量。

4. 将 2.0 μL 的 PKH linker 溶解在 0.25 mL 的 DiluentC 中。…4×Dye solution*

   *请配制合适的使用量。

5. 添加1/3样品量的 4×Dye solution 至样品中，混合后在室温中孵育 5-10 分钟。

6. 根据附带的操作说明用 PBS 平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo 公司）。

7. 将 100 μL 样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100 μL）。

   *准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好 Hela 细胞的培养皿中，24 小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

   *根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察

从 16 mL K562 培养上清液中超滤浓缩得到４mL 培养上清液作为样品，通过 PS 亲和法提取外泌体。

●　提取的外泌体蛋白质浓度：22.3 ng/μL

●　粒子浓度：1.2×10⁸ particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的 Hela 细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。

Opti-MEM：取相同量用 PKH 标记后添加到细胞中作为阴性对照。

 

◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作

　　样品预处理：对样品进行 1,200×g 离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行 10,000×g 离心操作※2。

　　下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。

更换缓冲液（限制过滤）操作

用 50 mL TBS 缓冲液对１mL 已经经过离心处理的 EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把 19 mL TBS 加进 VivaSpin20（100K）中。

2. 把 １mL 离心过的 EDTA 血浆上清添加在第１. 的VivaSpin20（100K）中，混匀。

3. 把第２. 的VivaSpin20（100K）在４℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 缓冲液。

5. ４℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 缓冲液。

7. ４℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 11 mL TBS 缓冲液。

9. ４℃下离心处理直至样品液量达到１mL 以下。

10. 进行提取。

 

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤

 

◆产品列表

产品编号	产品名称	包装
293-77601	MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Exosome 外泌体提取试剂盒PS	10次用
299-77603		2次用

◆相关产品

产品编号	产品名称	包装
016-27061	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63单抗（3-13）	20 μL
012-27063	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63单抗（3-13）	100 μL
CAC-SHI-EXO-M02-50UL	Anti CD63 for Exosome Isolation CD63 外泌体提取抗体	50 μL
CAC-SHI-EXO-M01-100UL	Anti CD9 for Exosome Isolation 外泌体分离抗体CD9	100 μL
CAC-SHI-EXO-M02-100UL	Anti CD63 for Exosome Isolation 外泌体分离抗体CD63	100 μL
CAC-SHI-EXO-M03-100UL	Anti CD81 for Exosome Isolation 外泌体分离抗体CD81	100 μL
CSR-SHI-EXO-K010	ExoTrap™ Exosome Isolation Spin Column Kit,  for Protein Research 外泌体分离亲和柱套装，蛋白研究用	1 kit
290-35591	Magnet Stand MagCapture系列磁珠捕获用磁力架	1个

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新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

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PS亲合法

　　通过使用Ｔ细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白４（Tim４）分离高度纯化的外泌体。Tim４是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白，其强烈结合磷酯酰丝氨酸，不仅显示在凋亡细胞上，而且显示在外泌体和微泡。使用 Tim４蛋白，其特异性结合显示在外泌体表面上的磷酯酰丝氨酸。因为结合是 Ca²⁺依赖性的，完整的外泌体可以通过添加 Ca²⁺螯合剂容易地从 Tim４释放。值得注意的是，利用 PS 亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过 ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过 Tim４蛋白纯化的有用性表征 Evs 的真正功能。

（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）

外泌体分离及分析产品系列	Wako外泌体英日文说明书
成功研发提取高纯度外泌体方法

◆操作流程

样品制备流程（步骤１）

外泌体捕获固定流程（步骤２）

亲和提取流程（步骤３—５）

外泌体提取血浆样品前处理步骤

使用 TBS 缓冲液进行缓冲液交换

1、向 VIVASPIN 20（100K）中添加 19 mL TBS 缓冲液。

2、将１mL 血浆添加到（步骤１）的 VIVASPIN 20（100K）中并混合。

3、离心（步骤２）中的 VIVASPIN 20（100K）。（离心条件参考使用说明书）

4、当上层液体下降时，添加 10 mL TBS 缓冲液到（步骤３）的 VIVASPIN 20（100K）中。

5、离心。

6、当上层液体下降时，添加 10 mL TBS 缓冲液到（步骤５）的 VIVASPIN 20（100K）中。

7、离心。

8、当上层液体下降时，添加 11 mL TBS 缓冲液到（步骤７）的 VIVASPIN 20（100K）中。

9、离心 VIVASPIN 20（100K），直到样品体积变为１mL。

该方案共计使用 50 mL 的 TBS 缓冲液。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

常见问题

◆试剂盒的规格、性能

Q1-1：本提取方法的原理是什么？

A1-1：本提取方法利用了Tim4蛋白对存在于外泌体为代表的的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles : EVs）膜表面的磷脂酰丝氨酸（以下称 PS），

           以金属离子依赖性的方式进行结合以提取外泌体等的细胞外囊泡。是无需使用抗体的亲和提取法。

 

Q1-2：用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢？

Ａ1-2：可提取 PS 暴露于脂质膜表面的外泌体和微囊泡。

Q1-3：外泌体和微泡的区别是？

Ａ1-3：外泌体和微囊泡的区别在于其产生的方式不同。从晚期胞内体分泌的细胞外囊泡称为外泌体，从细胞膜直接出芽产生的细胞外囊泡称为微

            囊泡。二者的大小也有所不同，外泌体的粒子直径约 40~100 nm，微囊泡的粒子直径约 100~1,000 nm，但有报道发现也存在小直径的

            微囊泡，所以无法从粒子大小来明确区分二者。

 

Q1-4：外泌体和微泡能可以分别纯化吗？

Ａ1-4：如上面所述，无法明确区分二者的大小，所以无法将二者完全分开。推荐使用下列简便的提取方法以便获得各主要的组分：提取外泌体等

            粒子直径小的细胞外囊泡（Small EVs）时，请选用 10,000×g 离心后的上清样品；提取含微囊泡在内的粒子直径大的细胞外囊泡

          （Large EVs）时，首先要回收 1,200×g 离心的上清，然后将其 10,000×g 离心分离获得的沉淀用TBS悬浮后作为样品使用。

Ａ1-4：如果同时提取上述两种细胞外囊泡，请使用 1,200×g 离心分离的上清作为样品。

Ａ1-4：详细的样品预处理条件请参考产品的使用说明书。

Q1-5：会回收到外泌体、微囊泡以外的东西吗？

A1-5：会回收到带包膜的病毒，因为包膜病毒的膜表面也会暴露 PS 。利用这个特点也可以将本试剂盒应用于包膜病毒的提取实验。若想进一步

           分离出细胞外囊泡与包膜病毒，使用本试剂盒提取后，必须使用病毒特异性抗体进行亲和提取。本方法也适用于对包膜上有着 CD63 等外

           泌体标记的包膜病毒提取。

 

Q1-6：外壳型病毒也能回收吗？所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）吗？

A1-6：在以下论文中，报告了使用本方法的病毒纯化。

A1-5：“Vesicle-Cloaked Virus Clusters Are Optimal Units for Inter-organismal Viral Transmission”, M. Santiana, et al., 

            Cell Host & Microbe, 24, 208-220 （2018）

Q1-7：所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）吗？

A1-7：虽然没有证据表明所有的外泌体都暴露了 PS，但是在 FUJIFILM Wako 的操作实例（参考：纯化实绩和检测实绩）中，尚未发现无法检测

           的样品。

A1-7：在以下的论文中报告了使用冷冻电子显微镜以及免疫金胶体颗粒的活性化血小板来源细胞外囊泡的表型分析。

A1-7：据该论文报道，约 75% 的活性化血小板来源细胞外囊泡都会在其表面暴露 PS。

A1-：“Extracellular vesicles from activated platelets : a semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study”, 

            B. Alain R, et al., Platelets, 28（3）,263-271（ 2017）

Q1-8：本试剂盒可以从哪些样品中提取外泌体？一次能回收多少外泌体？

A1-8：FUJIFILM Wako 的操作实例中，有使用过细胞培养上清、血清、肝素-血浆、EDTA 血浆、尿液、粪便等作为提取样品。另外，也有用户使

           用本试剂盒，从脑脊髓液和唾液中提取外泌体。

Q1-9：一次能回收多少外泌体？

A1-9：实验样品的种类和体积不同，回收到的外泌体量也大不相同。在 FUJIFILM Wako 的操作实例中，一次提取操作可获得约30 μg/mL的蛋白

         （BCA 法检测），粒子数１~２×10¹⁰（NanoSight LM10 检测）（经莫能菌素钠（产品编号：ALX-380-026-G001）刺激外泌体分泌的

           K562 培养上清５mL 浓缩为１mL 后，对其进行纯化）。从１mL 正常人混合血清提取一次，可回收约 34 μg/mL 蛋白（ BCA 法检测），

           粒子数约５×10⁹/mL（NanoSight LM10 检测）。本试剂盒最终可获得 100 μL 的洗脱液。

Q1-10：能从小鼠血清中分离外泌体吗？

A1-10：可以。在 Western blotting 中检测 CD9 的实验案例如下：

A1-10：标准样品：小鼠血清 500 μL

A1-10：分离的外泌体总量：100 μL（蛋白浓度：17 ng/μL，BCA）

A1-10：各条带的分布量：10 μL

A1-10：一抗：BioLegend Purified anti-mouse CD9 Antibody（产品编号：124802）

A1-10：二抗：抗大鼠 IgG，过氧化物酶标记

◆与传统法比较

Q2-1：与超离相比的优势是什么？

A2-1：与超离法相比，本试剂盒能更简便地回收高纯度外泌体，且重复性好，回收率高。还能提:取超速离心法难以沉淀的外泌体。

A2-1：所提取的外泌体纯度高，相当于超离法和密度梯度法相结合时得到的外泌体组分。

Q2-2：与抗体亲和法相比，PS亲和法的优势是什么？

A2-2：抗体亲和法使用外泌体表面抗原相对应的抗体，必须用变性剂洗脱在酸性条件下分离提取外泌体。而本试剂盒是在中性环境下用螯合剂来

           洗脱的，能提取近乎完整的外泌体。由于洗脱过程无需使用变性剂，磁珠非特异性吸附蛋白杂质少，能回收更高纯度的外泌体，且外泌体

           回收率更高。

A2-1：标记蛋白的表达量随外泌体来源细胞的不同而有所差异，传统抗体亲和法只能特异性识别一种外泌体表面标记蛋白，与之相比，本试剂盒

           可特异性识别膜脂质成分，回收范围更广。另外，有实例证明识别表面标记蛋白的抗体不能识别不同动物种抗原，而本试剂盒能运用于大

           范围的动物物种中（人，小鼠，牛等都有实例）。

Q2-3：与聚合物沉淀法相比，其优点是什么？

A2-3：与聚合物沉淀法相比，回收效率更高，而且可提取更高纯度的外泌体。

 

◆试剂盒的操作方法、组成

Q3-1：操作本试剂盒耗时多久？

A3-1：样品预处理约１h，试剂盒所有的步骤总计需要 3.5 h 。具体操作步骤包括：

           ①外泌体捕获磁珠的固定需要 15 min；

           ②与样品反应需要３h；

           ③外泌体的清洗和洗脱需要约 35 min。可以将于样品反应的时间缩短至１h，但需要进行预实验确认对实验结果没有影响。

Q3-2：使用本试剂盒时，有哪些需要特别慎重的操作吗？

A3-2：Exosome Capture 固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。

A2-1：提取时在提取液中加入磁珠后，确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。

 

Q3-3：提取液的组成有哪些？

A3-3：是含有１mM 的螯合剂、盐、防腐剂的 Tris 基础溶液。若以上成分阻碍后续分析，请使用超速离心膜（Sartorius公司  VivaSpin500，

           使用 100K 分子量截留，产品编号：VS0141）并替换合适的 Buffer 。

 

Q3-4：外泌体捕获固定化磁珠可以循环利用吗？

A3-4：可以。为了能够重复回收样品中残留的外泌体，使用过的磁珠最多可再回收利用４次。试剂盒内缓冲液量充足，如果是从同一样品中重复

           提取或实验对污染没要求，10 次用试剂盒最多可进行 50 次反应。如果样品体积大于１mL 或样品已浓缩，建议可对磁珠进行回收循环利

           用。详情参考使用说明书。

 

Q3-5：外泌体捕获固定化磁珠能保存吗？

A3-5：可以。重复利用外泌体洗脱后的外泌体捕获固定化磁珠时，请使用试剂盒配套的 Washing buffer 或自行配制的 TBS 冷藏保存

         （FUJIFILM Wako实例：２年）

 

Q3-6：实验操作中有可以留到第二天的步骤吗？

A3-6：Exosome Capture 固定化磁珠与样品的反应步骤（反应时间３h）可以反应过夜反应。

 

◆样品用量

Q4-1：样品纯化所需的最低量是多少？

A4-1：为了稳定地让磁珠和样品混合，使用旋转混合仪反应时请准备 500 μ L以上的样品，使用试管混合器时请准备 100 μL 以上的样品。

A2-1：若使用的样品量比上述的少时，请添加 TBS 至高于最低上样量，再与外泌体捕获固定化磁珠反应。另外，用于补平的TBS推荐添加

           EV-Save™。

 

Q4-2：可以从大量的样品中回收吗？

A4-2：浓缩后可再回收。如果是培养上清的情况下，最多可以从 50 mL 的样品中提取外泌体。请将离心分离预处理后的 50 mL 细胞培养上清超

           虑浓缩至１mL（推荐超滤管：Sartorius Vivaspin20，截留分子量 100 K、产品编号：VS2041）。可兼容无血清培养基及含10% FBS的

           培养基。由于血清样品无法浓缩，最多只能用１ｍL 的样品。详情参考产品说明书。

A2-1：另外，通过超滤浓缩外泌体会吸附在容器或滤膜上而减少。在进行超滤时，请添加 EV-Save™ 细胞外囊泡吸附抑制剂（产品编号：

           058-09261），防止吸附损失。但是由于 EV-Save™ 本产品含有聚合物，不建议使用于蛋白组学分析的样品。

Q4-3：超滤浓缩中推荐使用截留分子量 100 K，可以使用 10 K 吗？

A4-3：FUJIFILM Wako 经过比较 100 K，300 K，1000 K 的超滤管，从浓缩时间和浓缩的外泌体量的结果来看，推荐使用 100 K。虽然 10 K 

           和 30 K 也可以使用，但是浓缩时间可能会变长。另外若培养基含有可被浓缩的白蛋白，可能会降低回收效率。

◆外泌体提取后的分析

Q5-1：外泌体中含有什么？

A5-1：含有蛋白质、脂质、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。

 

Q5-2：提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测？

A5-2：因为能得到完整的细胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。

A2-1（例）蛋白质分析：蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA 等核酸分析如：定量 PCR、微阵列（生物芯片）、

                                         新一代测序等粒子分析：电镜分析，纳米位点分析（NTA）等

A2-1：功能分析：体内外的用药实验等

Q5-3：提取后的细胞外囊泡（EVs）能直接用于细胞的摄取实验中吗？

A5-3：由于试剂盒配套的洗脱缓冲液中的防腐剂有细胞毒性，请另行制备含 2 mmol/L EDTA 的 PBS 缓冲液作为洗脱缓冲液。获得的纯化细胞外

           囊泡样品用针头式过滤器（Millipore Ultrafree-MC，GV 0.22 μm sterile，产品编号：UFC30GV0S）进行除菌，用于细胞摄取实验等。

           甚至为防止吸附而添加了EV-Save™ 的细胞外囊泡样品，也可直接用于实验。

Q5-4：电镜分析需要的外泌体量是多少？

A5-4：FUJIFILM Wako 在电镜分析中使用２~４×10¹⁰ particles/mL（用 NanoSight LM10 检测）的样品。

Q5-5：微阵列分析需要的外泌体量是多少？

A5-5：FUJIFILM Wako 从下述的粒子数（用 NanoSight LM10 检测）的外泌体中提取 RNA，进行微阵列分析。

A5-5：COLO201: 4.6×10¹⁰ particles

A5-5：TIG3: 1.7×10¹⁰ particles

A5-5：iPS: 1.9×10⁹ particles

Q5-6：蛋白组学分析需要的外泌体量是多少？

A5-6：外泌体提取、纯化试剂页面所介绍的蛋白组学分析（W. Nakai, et al., Sci. Rep., 6, 33935, 2016）中，使用了约 1 μg 的纯化外泌体。（该

           外泌体来源于约 1.5 mL 的 K562 细胞培养上清样品。该样品以莫能菌素（产品编号：ALX-380-026-G001）促进外泌体的分泌，使外泌体

           的量增多。）

Q5-7：如何保存纯化的细胞外囊泡？

A5-7：添加 EV-Save™ 细胞外囊泡封闭试剂（产品编号：058-09261），冷藏或冷冻保存。长期保存请置于-80℃。

A2-1：EV-Save™ 有冷冻保护作用，可使冻存的纯化细胞外囊泡不受损伤。但是由于本产品含有聚合物，不建议用于蛋白组学分析样品。

◆关于外泌体标记

Q6-1：如何确认用本试剂盒纯化的外泌体？

A6-1：根据表面抗原的抗体（WB）、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量（如 NanoSight LM10）等来验证。

 

◆相关产品

Q7-1：可以提供可用于 Western blotting 的外泌体标记检测抗体吗？

A7-1：FUJIFILM Wako提供有应用实例的以下抗体：

抗原	反应	抗体	制造商	应用
CD63	人	抗CD63小鼠单克隆抗体（3-13）	Wako，产品编号： 016-27061、012-27063	WB、ELISA、FCM、IP
CD81	人、牛	抗CD81小鼠单克隆抗体（17B1）	Wako，产品编号： 015-27771、 011-27773	WB、ELISA、FCM、IP
CD9	人、牛	抗CD9小鼠单克隆抗体（1K）	Wako，产品编号： 018-27761、014-27763	WB、ELISA、FCM、IP
TSG101	人	抗Tsg101小鼠单克隆抗体（4A10）	Novus，产品编号：NB200-112	WB
Alix	人	抗Alix小鼠单克隆抗体（3A9）	Novus，产品编号：NB100-65678	WB

 

Q7-2：有可以从分离囊泡里提纯 RNA 的试剂盒吗？

A7-2：有。可使用 microRNA Extractor SP Kit（产品编号：295-71701）比 AGPC 法更能高效提纯 RNA。

Q7-3：FUJIFILM Wako 也可以提供磁力架吗？

A7-3：有的。FUJIFILM Wako 也提供磁珠捕获用磁力架（产品编号：290-35591）。

◆实验条件

Q8-1：莫能菌素钠的使用条件是什么？

A8-1：培养 K562 细胞时使用的莫能菌素钠的最终浓度为 10 μmol/L。用乙醇溶解莫能菌素钠（产品编号：ALX-380-026-G001），配制成 

           10 mmol/L，按 1/1000 体积添加到培养基中使用。

A8-1：参考文献：

A8-：“Exosome Release Is Regulated by a Calcium-dependent Mechanism in K562 Cells. J Biol Chem., 

A8-1：2003 May 30, 278（ 22）, 20083-90.”

Q8-2：阳性对照样品应该怎么准备？

A8-2：培养 HEK293 等任意的对照细胞，准备所需要的细胞培养上清量，用 FUJIFILM Wako 的试剂盒纯化外泌体。纯化的外泌体可以用 

           Western blotting 或 ELISA 分析以鉴定 CD9、CD63、CD81 等外泌体标记蛋白的表达情况。

A8-1：另外，关于培养条件举一个 FUJIFILM Wako 实验室里的案例，在血清培养基中培养一天后，更换为无血清培养基和含去外泌体的

           FBS 的培养基，培养３天左右后收集细胞培养上清。

Q8-3：BCA Assay 的操作步骤是什么？

A8-3：请按照以下的操作，制备标准品的标准曲线。由于本试剂盒中分离纯化的外泌体的蛋白浓度非常低，建议无需稀释直接进行检测。

A8-1：① 把 250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL 的 BSA 标准溶液、空白标准品分别以 25 μL/孔添加至 96 孔板孔中；

A8-1：② 把外泌体溶液和洗脱缓冲液（空白）以 25 μL/孔添加至 96 孔板中；

A8-1：③ 添加 200 μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）配套的试剂Ａ和试剂Ｂ的混合液（Ａ：Ｂ=50：1）至上述的①，②中；

A8-1：④ 60℃ 孵育 30 min；

A8-1：⑤ 室温冷却孔板；

A8-1：⑥ 在 560 nm 下检测吸光度。

◆疑难

Q9-1：实验不熟练的人员应作何准备？

A9-1：参照Ｑ36准备阳性对照。另外，也有培养基中的细胞外囊泡较少的可能性，可以适当扩大培养量。

Q9-2：与其他方法回收的外泌体样品相比，本试剂盒纯化的外泌体样品的总蛋白量偏少，这是什么原因呢？

A9-2：由于其他方法回收的外泌体样品中，存在许多杂质，所以总蛋白量会变多。另一方面，虽然本试剂盒纯化外泌体样品的总蛋白量少，但是样

           品的纯度高，所获得的外泌体量不比其他方法少。

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