体液样本中细胞外囊泡的分析工具

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）

 

　　本试剂盒是可用于细胞培养上清和体液样本中细胞外囊泡的定性分析以及定量分析的酶联免疫试剂。将能与细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合的蛋白质预包被到板上，细胞外囊泡与其反应被固定后，以目的细胞外囊泡表面标记蛋白的生物素标记抗体作为检测一抗，以试剂盒中的HRP标记链霉亲和素为二抗，可高灵敏度检测表面具有靶标记蛋白的细胞外囊泡。同时，可用不同物种的生物素标记抗体作为检测一抗。此外，二抗采用HRP标记链霉亲和素，与血液成分的非特异性结合低，可高灵敏度检测血液样本中的细胞外囊泡。

 

◆特点

●　高灵敏度和定量检测

　  可以直接检测样本中的细胞外囊泡（无需分离）

　  可以从2.5 μL左右的血液样本中检测细胞外囊泡（节约样本）

　  灵敏度是WB法的50~1000倍（检测微量信号）

●　应用广泛

      可定性或定量检测培养上清和血液样本中的细胞外囊泡

      测定EV-depleted FBS中残留的细胞外囊泡数量

      使用凝集素分析外泌体的糖链

●　通用的生物素标记检测方法

      一抗可灵活更换成不同动物来源的抗体或凝集素等的生物素标记一抗

●　操作简单以及再现性高

      优化细胞外囊泡检测用的试剂盒和试剂

 

◆检测原理

　　

　　Wako试剂盒PS Capture™ Exosome ELISA Kit（Anti Mouse IgG POD）（Code No. 297-79201）（图右）中，一抗使用小鼠抗体，二抗使用抗小鼠IgG抗体，但是本试剂盒（图左），使用生物素标记抗体作为一抗，二抗使用HRP标记的链霉亲和素。因此，可以不受限于抗体种类分析细胞外囊泡。

 

◆试剂盒组成

试剂盒组成（96次用）	容量
Exosome Capture 96 Well Plate	1块（8 well×12 strips）
Reaction Buffer	80 mL×1支
Washing Buffer (10×)	100 mL×1支
Exosome Binding Enhancer (100×)	10 mL×1支
Control Biotinylated Antibody Anti-CD63 (100×)	120 μL×1支
HRP-conjugated Streptavidin (100×)	240 μL×1支
TMB Solution	12 mL×1支
Stop Solution	12 mL×1支
Plate Seal	4块
使用说明书	1份

◆对应样本

样本	定性分析	定量分析
细胞培养上清液	可以实现○	可以实现○
体液样本	可以实现○	可以实现○

◆数据

■　血液样本以及培养上清液样本的稀释线性（Linearity）

用从COLO201细胞培养上清液中纯化的细胞外囊泡制成的标准曲线为基准，检测①人血清稀释样本，②人肝素血浆稀释样本，③人EDTA血浆稀释样本（各2个样本，稀释4次）以及④COLO201细胞培养上清液稀释4次的样本中的外泌体浓度（检测CD63），评价各个样本的稀释线性。

 

结果表明，在CD63检测中，血清和肝素血浆样本在双倍稀释或更高稀释度下可获得良好的线性。EDTA血浆样本在5倍以上稀释度下可获得良好的线性。

 

■　PS亲和法和抗体法的比较（捕获EVs的能力）

将预处理^※1的各个细胞培养上清液分别添加至已固相化的抗CD抗体(CD9, CD63, CD81)或Tim4微孔板的各个孔中进行反应。然后，用各个生物素标记抗CD抗体(CD9, CD63, CD81)检测结合的外泌体。

※1 预处理条件: 10,000×g, 30分

PS亲和法与抗体法相比，更高效率地捕抓到了各种细胞株来源的外泌体

■　测定市面上“无外泌体血清”中残留的外泌体数量

用生物素标记抗CD9抗体^※4检测未处理的FBS，市场上售卖的“无外泌体血清”（ EV-depleted FBS）以及超离处理的FBS (UC-treated FBS)^※3 中残存的外泌体。

※3 超离条件: 160,000×g, 16 h

※4 用Biotin Labeling Kit-SH (产品编号 348-90941)标记抗CD9抗体 (产品编号014-27763)。

Capture: Tim4 / Detection: 生物素标记抗CD9抗体

使用PS亲和法的ELISA系统，可以简单便利地检测到外泌体残留量。

■　应用于糖链分析：rBC2LCN凝集素和Tim4的双抗夹心ELISA

用生物素标记抗CD63抗体（产品编号 019-27713）和生物素标记rBC2LCN凝集素^※6检测预处理完成^※5的5倍稀释iPS细胞培养上清液中的外泌体。

※5 预处理条件: 10,000 × g, 30 min

※6用 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (ThermoFisher公司)标记rBC2LCN (产品编号029-18061)。

捕获用抗体: Tim4 / 检测用抗体: 各生物素标记体

＜参考文献＞　S. Saito, et al., Sci. Rep., 8, 3997 (2018)

通过与各种凝集素相组合，可应用于外泌体表面上的糖链分析。

■　检测人正常血液样本中外泌体标记物的相对浓度

准备人血清（10个样本），EDTA血浆（9个样本）和肝素血浆（9个样本）作为正常血液样本，检测外泌体标记物CD63和CD9，以及被认为是癌细胞外泌体特异性标记物的EpCAM。

结果显示，在各个血液样本中均检测出了外泌体标记物CD63和CD9，但只有在癌细胞外泌体中才检测出极微量的表面抗原EpCAM。

 

■　COLO201来源纯化外泌体的添加回收测试

准备混合血清，EDTA血浆，肝素血浆的2倍稀释液，并添加从COLO 201细胞培养上清中提取的3种浓度的COLO201来源外泌体，以EpCAM检测来确认回收率。

在EpCAM检测中，添加回收率在100％±10％的范围内，显示出良好的回收性能※。

※考虑到【血液检体的稀释线性】，EDTA血浆样本建议稀释5倍以上进行检测。

◆产品列表

产品编号	产品名称	规格	包装
298-80601	PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP） PS Capture™ Exosome ELISA Kit （Streptavidin HRP）	基因研究用	96 次

◆抗外泌体标记抗体系列

产品编号	产品名称	交叉反应	包装
018-27761	Anti CD9, Monoclonal Antibody (1K) 抗CD9单克隆抗体（1K）	人，牛	20 µL
014-27763			100 µL
016-27061	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63，单克隆抗体（3-13）	人	20 µL
012-27063			100 µL
015-27771	Anti CD81, Monoclonal Antibody (17B1) 抗CD81单克隆抗体（17B1）	人，牛	20 µL
011-27773			100 µL
产品编号	产品名称	偶联基团	包装
018-27641	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Fluorescein   Conjugated 抗CD63，单克隆抗体（3-13），荧光素结合	绿色荧光素	25 次用
014-27643			100 次用
011-27751	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Red Fluorochrome(635) Conjugated 抗CD63单克隆抗体（3-13），红色荧光染料（635）偶联	红色荧光素	25 次用
017-27753			100 次用
013-27711	Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Biotin Conjugated 抗CD63单克隆抗体（3-13），生物素偶联	生物素	20 µL
019-27713			100 µL

◆相关产品

产品编号	产品名称	规格	包装
299-77603	MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	基因研究用	2 次
293-77601			10 次
297-79201	PS Capture™ 外泌体ELISA 试剂盒（抗小鼠IgG POD） PS Capture™ Exosome ELISA Kit （Anti Mouse IgG POD）	基因研究用	96 次
297-79701	PS Capture™外泌体流式试剂盒 PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit	基因研究用	300 次
016-27061	抗CD63，单克隆抗体（3-13） Anti CD63, Monoclonal Antibody （3-13）	免疫化学用	20 μL
012-27063			100 μL

欲了解更多相关产品信息，请点击：

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）

PS Capture™ Exosome ELISA Kit(Streptavidin HRP)

常见问题

◆试剂盒规格、功能

Q1-1：一定要制备标准品吗？制备标准品时，是否必须使用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS？

A1-1：定量检测时，需要制备作为标准品的细胞外囊泡。超速离心法和聚合物沉淀法等提取的细胞外囊泡也可作为

A1-1：标准品，但还是推荐使用与检测原理相同的PS亲和法提取的细胞外囊泡作为标准品。（详细制备方法请参

A1-1：考MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS的使用说明书）。

Q1-2：为什么没有配套的标准品？

A1-2：每种细胞分泌的细胞外囊泡的表面标记蛋白的种类和含量存在差异，标准品和检测样品的来源细胞必须一

A1-1：致。因此本试剂盒未配套标准品，请制备与样品相同来源细胞的细胞培养上清中提取的标准品。

Q1-3：血清、血浆样品可直接检测吗？

A1-3：PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（Streptavidin HRP）可以直接检测。

A1-1：但是PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）配套的检测二抗与人、小鼠、大鼠IgG发生

A1-1：非特异反应，不适用于人、小鼠、大鼠的血清和血浆样品的直接检测。

 

Q1-4：细胞培养上清样品可直接测定吗？

A1-4：无论哪个试剂盒都可以直接检测。由于PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）配套的一抗

A1-1：（抗CD63抗体）和二抗都不与牛IgG发生非特异性反应，可直接检测无血清培养基和含FBS培养基的细胞培

A1-1：养上清。另外，PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）配套的生物素标记抗体（抗CD63-生

A1-1：物素），链霉亲和素HRP也相同。

A1-1：请用于细胞培养上清样品中的细胞外囊泡的定量分析和定性分析。

 

Q1-5：可以变更一抗吗？

A1-5：可以。使用PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）时，先选择想检测的表面标记小鼠抗

A1-1：体，请根据使用说明书确定最佳浓度。

A1-1：使用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）时，先选择任意的表面标记检测用生物素标记抗

A1-1：体，请根据使用说明书确定最佳浓度。无法获取生物素标记抗体时，可以使用Biotin Labeling Kit-SH（产

A1-1：品编号：348-90941）或Biotin Labeling Kit-NH2（产品编号：347-90891）非标记抗体进行生物素标记。

 

Q1-6：残留的试剂应该如何保存？

A 1-6：请参考使用说明书的【6.试剂盒拆分使用时，各组成试剂的保存方法】。

 

Q1-7：哪些细胞是有纯化实例以及检测实例的细胞。

A1-7：下表为Wako已测试过的细胞系

细胞株	来源	Isolation	ELISA
A549	人肺泡基底上皮腺癌	ー	〇
BxPC-3	人胰腺癌	ー	〇
COLO201	人结肠癌	〇	〇
COS7	非洲绿猴肾	〇	〇
FM3A	小鼠乳腺癌	〇	〇
HCT116	人结肠癌	〇	〇
HEK293	人胚胎肾	〇	〇
HEK293T	人胚胎肾	〇	〇
HeLa	人宫颈癌	〇	〇
HPAF Ⅱ	人胰腺肿瘤	ー	〇
HuH-7	人肝癌	〇	〇
HUVEC	人脐静脉内皮细胞	〇	〇
iPS	诱导多能干细胞	〇	〇
K562	人慢性粒细胞白血病	〇	〇
LNCaP	人前列腺癌	〇	〇
P388D1	小鼠白血病	〇	〇
Panc-1	人胰腺癌	ー	〇
RAJI	人伯基特淋巴瘤·B淋巴细胞样	〇	〇
SH-SY5Y	人神经母细胞瘤	ー	〇
TIG-3	正常的二倍体成纤维细胞	〇	〇
THP-1	急性单核细胞白血病	〇	〇
U2OS	人骨肉瘤	〇	〇
BM-MSC	骨髄来源间充质干细胞	〇	〇
iCell-MSC	iPS 来源间充质干细胞-01279	〇	〇

ー：未测试     〇：有纯化和检测数据

Q1-8：本试剂盒可以检测细胞外囊泡的回收率吗？

A1-8：可以，请参考P25的与聚合物沉淀法比较回收率。

◆与传统方法比较

Q2-1：检测灵敏度高吗？

A 2-1：已证实该试剂盒检测细胞外囊泡，相比使用固相化抗体的ELISA方法或将纯化样品直接固定在平板上的灵敏

A1-1：度要更高。此外，已经实验验证本试剂盒与Western blotting有相关性。

◆试剂盒的操作方法、组成

Q3-1：本试剂盒的操作时间需要多久？

A 3-1：PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）的操作流程需要约5 h。具体包括：①将细胞外囊

A1-1：泡样品固定在孔板上需要2 h；②一抗的反应需要1 h；③二抗反应需要1 h；④TMB反应需要30 min。再加

A1-1：上其他清洗操作，大约需要5 h才能完成检测。

 A1-1：PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（ 链霉亲和素HRP）的操作流程需要约6 h。具体包括：①将细胞外囊泡

A1-1：样品固定在孔板上需要2 h；②一抗的反应需要1 h；③链霉亲和素 HRP反应需要2 h；④TMB反应需要30 

A1-1：min。再加上其他清洗操作，大约需要6 h才能完成检测。

A1-1： 添加终止液后，检测450 nm和副波长620 nm（600~650 nm）的吸光度。

 

Q3-2：Exosome Capture 96 Well Plate是可循环使用的吗？

A 3-2：终止液会使孔板上的蛋白变性，因此不可循环利用。

 

Q3-3：实验操作中有可以留到第二天的步骤吗？

A 3-3：将各样品固定在孔板上并保存于4℃，过夜反应也是没有问题的。

◆样品用量

Q4-1：检测使用的样品的最低量是多少？

A 4-1：有相当于1 ng左右细胞外囊泡的蛋白即可检测。从COLO201细胞培养上清中提取的细胞外囊泡检测界限为

A1-1：11 pg。（细胞系不同检测界限也随之变化。）

 

Q4-2：直接检测培养上清和体液样品时，需要多少样品？

A 4-2：几微升（1~5 μL）左右的细胞培养上清和体液样品即可充分检测。建议用于检测培养基中的细胞外囊泡量

A1-1：随时间变化，以及分析新型培养上清样品。但由于细胞类型（iPS细胞等）不同，可能出现培养基中的细胞

A1-1：外囊泡量少的情况。不清楚样品中的细胞外囊泡量时，推荐进行预实验确定合适的上样量。

◆相关产品

Q5-1：有推荐使用的一抗吗？

A5-1：以下抗体是Wako已验证可在该ELISA法中使用的抗体。

抗原	反应	抗体	生产商	应用
CD9	人、牛	抗CD9小鼠单克隆抗体(1K)	Wako, 产品编号： 018-27761, 014-27763	WB、ELISA、FCM、IP
CD63	人	抗CD63小鼠单克隆抗体(3-13)	Wako,产品编号： 016-27061, 012-27063	WB、ELISA、FCM、IP
CD81	人	抗CD81小鼠单克隆抗体(17B1)	Wako, 产品编号： 015-27771, 011-27773	WB、ELISA、FCM、IP
CD9	小鼠	抗CD9大鼠单克隆抗体(MZ3)	Bio Legend, 产品编号：124802	ELISA
CD63	小鼠	抗CD63大鼠单克隆抗体(NVG-2)	Bio Legend, 产品编号：143902	ELISA
CD81	小鼠	抗CD81亚美尼亚仓鼠单克隆抗体(Eat-2)	Bio Legend, 产品编号：104902	ELISA

◆疑难

Q6-1：无法顺利检测结果，应该如何处理？

A6-1：请确认使用的各个试剂是否都还在有效期内。请务必添加Exosome Binding Enhancer（100×）至

A1-1：Washing Buffer。若是无法确认试剂盒配套的Control Primary Antibody Anti CD63（100×）和

A1-1：Control Biotinylated Antibody Anti-CD63（100×）的信号的情况下，请考虑CD63的表达量是否

A1-1：在检测界限之下或其他原因，或咨询Wako在当地的代理商。

参考文献

　

[1]	“A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles”, W. Nakai, T. Yoshida, D. Diez, Y. Miyatake, T. Nishibu, N. Imawaka, K. Naruse, Y. Sadamura ＆ R. Hanayama, Sci Rep 6, 33935 (2016).