可荧光定量活细胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的试剂

FAOBlue

FAOBlue是一款可以通过蓝色荧光可视化脂肪酸分解的共同途径——脂肪酸β-氧化（FAO）的活性的试剂。

通过荧光成像，可以简单地检测出过去难以检测的活细胞中的脂肪酸β-氧化活性。

该产品可广泛应用于对比评估不同细胞种类之间的β-氧化，探索促进或抑制β-氧化活性的化合物，β-氧化相关酶群的基础研究等领域。

 

※　本产品基于九州大学研究生院药学研究院药物发现化学生物学领域 王子田彰夫教授的研究成果，

※　由Funakoshi株式会社商品化并销售。

※　本产品仅供研究使用。

使用FAOBlue可视化HepG2细胞的FAO活性

添加FAOBlue到HepG2细胞中，观察活细胞成像，可从细胞中观察到蓝色荧光。另一方面，若使用FAO抑制剂进行前处理，则荧光强度明显减少，由此可知，蓝色荧光的强度取决于FAO的活性。

◆何为脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）

脂肪酸是构成细胞的各种脂质的基本要素，与葡萄糖、氨基酸并称为能源。尤其是在葡萄糖不足而饥饿的时候，脂肪酸会分解活跃，产生大量的ATP。虽然脂肪酸根据碳链的长短以及不饱和度的差别而存在不同的种类，但是由于它的分解属于线粒体等细胞器的共同分解途径，因此这种途径被统称为脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β-氧化主要通过4步酶反应——1）脂肪酸β位的氧化，2）β位的水合，3）β位的氧化，4）裂解，被阶段性分解为2个碳原子的短链脂肪酸和作为ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2个碳原子的短链脂肪酸再通过同一个循环，以2ⁿ个碳原子的短链脂肪酸重复分解。

研究提出，癌症以及非酒精性肝炎（NASH）等疾病中，脂肪酸β-氧化会出现很大的变动，因此开发检测脂肪酸β-氧化活性的方法备受期待。然而，在活细胞中检测多种酶参与的脂肪酸β-氧化一直以来都十分困难。

FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化应答型荧光探针，由九州大学研究生院药学研究院、专攻药物发现化学生物学领域的王子田彰夫教授开发。只需将产品添加到培养基中的简单操作，便可以通过荧光观察定量脂肪酸β-氧化活性。

◆原理

FAOBlue是一种在碳原子数为9的壬酸的碳链末端添加了蓝色荧光色素香豆素衍生物的化合物，此外，通过用乙酰氧基甲基酯保护末端脂肪酸来提高细胞膜透过性。虽然FAOBlue中含有香豆素衍生物，但是在该状态下，它不会在405 nm激发下发出荧光。

1. 附着在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性，因此FAOBlue可以跨越细胞膜，有效地摄入到细胞中。

2. 通过细胞内的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯，转换成游离脂肪酸的形态。

3. 通过脂酰CoA合成酶转换成脂酰CoA，摄入β-氧化途径。

4. 通过β-氧化循环壬酸（C9）按庚酸（C7）、戊酸（C5）、丙酸（C3）的顺序转换，在第四次β-氧化循环的丙酸

4. 被分解时，香豆素衍生物被释放出来。香豆素衍生物在405 nm激发下发出蓝色荧光。

5. 由于游离的香豆素衍生物扩散到整个细胞中，因此通过检测细胞内的蓝色荧光强度，可以实时且定量的评价β-氧

4. 化活性。

 

※　通过添加肉碱穿梭抑制剂的Etomoxir，有效地抑制了细胞内的荧光上升。

※　该结果证明FAOBlue主要检测线粒体的FAO活性。

◆特点

●　FAOBlue处于消光状态，分解后的游离香豆素衍生物呈现出比分解前更高的荧光强度。

●　添加培养基后，30 min~120 min后便可观察。

●　无需特别操作即可检测β-氧化活性。

●　实例验证能观察多种细胞类型的β-氧化。

●　有抑制药物依赖性β-氧化和因促进而引起的活性变化的成功检测案例。

●　检测波长：激发405 nm/荧光460 nm。

※　注意：

使用共聚焦激光显微镜时，推荐使用405 nm激光激发。如果本试剂在330～380 nm的范围内激发的话，会观察到无关FAO活性的370～450 nm（最大荧光波长410 nm）的荧光。使用荧光显微镜时，为了特异性观察FAO活性，推荐选择激发波长在390～430 nm范围内的激发光滤光片。详情请参考数据实例：FAO特异性吸收光谱、荧光光谱的变化。

◆原著论文

Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) .

”Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells.”

◆应用

●　评价各种细胞的β-氧化活性

●　β-氧化相关的基因基础研究

●　抑制或促进β-氧化的化合物的探索  等

◆操作方法概况

1. 在HBS中溶解FAOBlue至终浓度为5~20 μM^*1。

1. *1  针对不同的细胞类型，合适的浓度有所差异。建议根据具体实验进行探讨。

2. 去除培养基，用HBS清洗细胞2次。

3. 向细胞添加含有FAOBlue的HBS。

4. 在37°C下培养30 min以上^*2。

1. *2  针对不同的细胞类型，合适的培养时长有所差异。建议根据具体实验进行探讨。

5. 更换培养基后^*3，通过成像观察蓝色荧光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

1. *3  染色后的培养基更换是非必须的。即使不清洗也可进行观察。

实验注意点

由于本试剂使用405 nm的激发光，根据不同的观察对象，可能会观察到其自发的荧光。建议同时进行未添加本试剂的阴性对照实验。尤其是在显微镜下观察到点状荧光信号时，可能就是细胞的自发荧光。

 

◆应用实例

FAO特异性吸收光谱、荧光光谱的变化

FAOBlue以及香豆素衍生物的吸收光谱（左）和荧光光谱（右）。

FAOBlue在通过FAO转换成香豆素衍生物后，吸收最大值由350 nm变为405 nm的长波长。因此，在405 nm的激发条件下，FAOBlue不会发出荧光，只有在通过FAO释放香豆素衍生物时才会发出蓝色荧光。

 

※　注意：

若使用处于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激发，FAOBlue也会发出蓝色荧光（380～450 nm；最大波长400 nm）。若在荧光显微镜中使用普通的DAPI滤光片，将会同时激发未反应的FAOBlue以及FAO反应后的香豆素衍生物。所以在选择滤光片时请格外注意。

可视化各种细胞类型中的FAO活性

在4种癌细胞中加入FAOBlue，培养一定时间后进行荧光观察。所有细胞都观察到了蓝色荧光，而添加FAO抑制剂etomoxir后荧光显著衰减，由此可知，蓝色荧光是由FAO活性引起的。

※ 各种细胞的实验条件有所不同。

※ HepG2 : 5 μM, 30 min

※ LNCaP: 20 μM, 120 min

※ HeLa : 20 μM, 120 min

※ A549 : 5 μM, 30 min

观察刺激依赖性β-氧化的变化

向HepG2细胞添加脂质代谢促进剂AICAR^*2（200 μM，3 h）或部分FAO抑制剂ranolazine（200 μM，12 h）进行前处理后，添加FAOBlue（5 μM）培养30 min。进行荧光观察时，可以看到对比对照实验（未处理），AICAR中荧光强度明显增强，ranolazine中荧光强度明显降低。

＊2  AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活化剂具有活化脂质代谢的功能。

药物作用的定量分析

使用FAOBlue可以定量分析药物对FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）的候选治疗药ND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）前处理HepG2细胞4 h后，添加FAOBlue（5 μM）培养30 min。使用共聚焦激光显微镜评价蓝色荧光强度时，可以观察到依赖于ND-630浓度的荧光强度增加。由此可知，ND-630增强了FAO的活性。

NASH模型小鼠分析

非酒精性肝炎（NASH）是一种与脂质相关的疾病，已知会降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式给药增强脂质代谢的bezafibrate后，回收其肝脏制备初代培养肝细胞。向各个细胞加入FAOBlue（5 μM）观察其FAO活性，结果显示，对比正常小鼠来源细胞，NASH模型小鼠来源细胞的FAO活性明显被抑制。另一方面，我们可以看到给药bezafibrate的NASH模型小鼠来源细胞中FAO恢复了活性。

本试剂可用于脂质相关疾病模型中的FAO定量分析。

相关资料

FAOBlue