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凑单关联产品TOP5

NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    Glutamine Assay Kit-WST    谷氨酰胺的定量检测

NO.3.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    Mito-FerroGreen    铁离子荧光探针

　　谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。

Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。

　　本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。

　　只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。

　　标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:

据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。

Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：

将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。

结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。

<使用产品>

· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）

· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）

<实验条件>

细胞：A549细胞 (1 x 10⁶ cells) 　药物处理时间：48 h

参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.

1)Cobler,L.et al.,”xCT inhibition sensitizes tumors to γ-radiation via glutathione reduction”,Oncotarget,2018,9,32280-32297.

2)Tobias,M.et al.,”Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication”,Free Radical Bioglogy and Medicine,2019,133,144-152.

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NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.3.    Glutamate Assay Kit-WST    谷氨酸的定量检测

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    Mito-FerroGreen    铁离子荧光探针

谷氨酰胺是TCA循环的中间体α-酮戊二酸的主要来源，并且是用于核酸和其他氨基酸合成及能量产生的重要物质。根据文献报道特别是在癌细胞中，谷氨酰胺作为底物可促进Glutaminolysis的生成，而Glutaminolysis是产生α-酮戊二酸的途径之一。同时Glutaminolysis还可以消除活性氧并减少氧化型谷胱甘肽。

Glutamine Assay Kit-WST是用于定量检测谷氨酰胺的试剂盒。无论是培养基内还是细胞内的谷氨酰胺均可以通过WST的还原反应进行定量，可检测的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可使用96孔板进行多样品批量检测。

本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酰胺进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酰胺标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酰胺的浓度。

*向谷氨酰胺标准溶液和含有谷氨酰胺酶的样品孔中加入谷氨酰胺酶溶液，并在样品(不含谷氨酰胺酶溶液)的每个孔中加Reaction Buffer。

由下式算出检测样品中的谷氨酰胺浓度。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

1)Lingtao,J.et al.,”Glutamate dehydrogenase 1 signals through antioxidant glutathione peroxidase 1 to regulate redox homeostasis and tumor growth“,Cancer Cell,2015,27,257-270.

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NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.2.    Mito-FerroGreen    线粒体内亚铁离子检测

NO.3.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.4.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

NO.5.    ROS Assay Kit    活性氧检测 

MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。

聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP

(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用

荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

特点

1.特异性的在细胞中线粒体内聚集

2.可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物

3.可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

* 本产品由福冈大学化学系的Dr. Shioji开发

*由于MitoPeDPP量极少不宜看到，可以通过观察MitoPeDPP DMSO溶液的颜色是否为黄色来判断。

MitoPeDPP可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。

1.MitoPeDPP和线粒体染色试剂MitoBright共同染色的实施例

在HeLa细胞中添加t-BHP（氢过氧化叔丁基），检测脂质过氧化物

波长（wavelength/band pass）

MitoPeDPP：470/40（Ex），525/50（Em）

MitoBright DeepRed：600/50（Ex），685/50（Em）

结果证实在HeLa细胞内的线粒体中，MitoPeDPP受t-BHP氧化后会发出荧光。另外通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）的共染色，确认了MitoPeDPP的荧光是定位在线粒体中。

2.检测添加Rotenone产生的脂质过氧化物

向HeLa细胞[μ-slide，8孔（由Ibidi制造）]中添加MitoPeDPP之后，添加Rotenone溶液并使用荧光显微镜观察。实验结果证实，添加Rotenone后，检测到细胞中产生了脂质过氧化物。

Rotenone的刺激时间：0 min(左)，90 min(中)，180 min(右)

上部）荧光图，下部）明场图

3.神经细胞使用MitoPeDPP的实验例

A.荧光显微镜检测

向NIE-115细胞（小鼠神经芽细胞瘤）添加异黄素，诱导Ca2+流入细胞内，并通过MitoPeDPP的荧光染色来观察线粒体膜内的脂溶性过氧化物的产生。实验结果证实添加了异霉素的实验组相比对照组来说荧光更强。

B. 平均荧光强度数据比较

为了量化对照组细胞和添加了离子霉素的细胞的荧光强度，对两组数据进行基于平均荧光强度的比较。

结果证实，加入离子霉素后30分钟的细胞对比对照组的细胞，观察到的荧光强度显着增加。

数据提供（Free Radical Research, in press)

参照芝浦工业大学系统理工学院 福井浩二副教授、中村沙希[参考文献3]

4.MitoPeDPP反应的选择性

在不含细胞的反应体系中，MitoPeDPP可以与各种过氧化物如H2O2，t-BHP和ONOO- 反应，但是在细胞中，积

累在线粒体中的MitoPeDPP可以被t-BHP氧化而释放出较强荧光 (图3A)，却和其它ROS或RNS反应很弱 (图3B)。

A) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min，然后用100 μmol / l的t-BHP处理。

B) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min后，加入ROS、RNS诱导剂。

分别加入100 μmol / l (H2O2，NO和ONOO-诱导剂)和10  μmol / l  PMA（O2-.诱导剂） 。

左边为明场图，右边为荧光图

* t-BHP：tert-Butylhydroperoxide; PMA, Phorbol myristate acetate;

SIN-1, 3-(Morpholinyl)sydnonimine, hydrochloride;

NOC 7, 1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene

波长/带通滤波器：470/40 (Ex), 525 /50 (Em)

1) K. Shioji K, Y. Oyama, K. Okuma and H. Nakagawa, “Synthesis and properties of fluorescence probe for detection of peroxides in mitochondria.”, Bioorg Med Chem Lett., 2010, 20, (13), 3911.

2) S. Oka, J. Leon, K. Sakumi, T. Ide, D. Kang, F. M. LaFerla and Y. Nakabeppu, “Human mitochondrial transcriptional factor A breaks the mitochondria-mediated vicious cycle in Alzheimer’s disease”, Scientific Reports ., 2016, DOI: 10.1038/srep37889 , .

3) S. Nakamura, A. Nakanishi, M. Takazawa, S. Okihiro, S. Urano and K. Fukui, “Ionomycin-induced calcium influx induces neurite degeneration in mouse neuroblastoma cells: Analysis of a time-lapse live cell imaging system”, Free Radical Research., 2016, 50, (11), 1214.

4) M. Akimoto, R. Maruyama, Y. Kawabata, Y. Tajima and K. Takenaga, “Antidiabetic adiponectin receptor agonist AdipoRon suppresses tumour growth of pancreatic cancer by inducing RIPK1/ERKdependent necroptosis”, Cell Death Dis., 2018, 9, 804.

5) M. Álvarez-Córdoba, A. Fernández Khoury, M. Villanueva-Paz, C. Gómez-Navarro, I. Villalón-García, J. M. Suárez-Rivero, S. Povea-Cabello, M. Mata, D. Cotán, M. Talaverón-Rey, A. J. Pérez-Pulido, J. J. Salas, E. M. Pérez-Villegas, A. Díaz-Quintana, J. A. Armengol, J. A. Sánchez-Alcázar , “Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.”, Mol. Neurobiol. ., 2019, 56, (5), 3638.

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凑单关联产品TOP5

NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.2.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.3.    MitoPeDPP    线粒体内脂质过氧化物检测

NO.4.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测

NO.5.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的 永澤秀子 和 平山祐 博士的指导下开发。

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

1.线粒体定位

为了确认Mito-FerroGreen的是否特异性地在线粒体内定位，与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red※）一同进行染色，实验结果证实了Mito-FerroGreen选择性地染色在线粒体内。

向HeLa细胞中添加5μmol/ l的Mito-FerroGreen和200 nmol/l的线粒体染色探针MitoBright Deep Red，并在CO2培养箱中培养30分钟，然后添加100μmol/ l的硫酸铁铵（II），并将混合后的细胞溶液在CO2培养箱中培养1小时后通过观察荧光。

Mito-FerroGreen

激发波长：488 nm

发射波长：500-565 nm

MitoBright Deep Red

激发波长：640 nm

发射波长：656-700 nm

2.线粒体内的铁离子荧光成像

在含有血清的MEM培养基中接种HeLa细胞，并加入Mito-FerroGreen，通过荧光检测HeLa细胞众线粒体内的二价铁（左图）。而在添加了铁离子的HeLa细胞中，观察到了Mito-FerroGreen的荧光明显增强（中间图）。在添加了铁螯合剂的细胞中，几乎未观察到Mito-FerroGreen的荧光（右图）。 以这种方式，证实了线粒体中铁含量的差异和荧光强度的差异是成相关性的。

3.对二价铁离子的高度选择性和高信号

向1ml 50mmol/l HEPES Buffer（pH7.4）中加入2μl 1mol/l Mito-FroGreen、2μl 10mmol/l各种金属以及20μl 1mg/ml酯化酶，在室温下反应1小时后测定荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

4.适用于通用滤光片

Mito-FerroGreen的激发波长为488nm，最大激发波长可达505nm。

向3ml 50 mmol/l HEPES Buffer (pH7.4) 中加入 6μl 1mol/l Mito-FroGreen、6μl 10mmol/l硫酸铵铁（Ⅱ）以及20μl 1mg/ml酯化酶。在37℃下反应1小时后检测荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

1) T. Hirayama,  S. Kadota, M. Niwa  and  H. Nagasawa, “A mitochondria-targeted fluorescent probe for selective detection of mitochondrial labile Fe(II)”, Metallomics., 2018, DOI: 10.1039/C8MT00049B

2) T. Issitt, E. Bosseboeuf, N. Winter, N. Dufton, G. Gestri, V. Senatore, A. Chikh, A. Randi, C. Raimondi, “Neuropilin-1 controls endothelial homeostasis by regulating mitochondrial function and iron-dependent oxidative stress via ABCB8”, iScience., 2018,DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.005 .

3) E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 “, J Physiol Sci., 2018,doi:10.1007/s12576-018-0652-2.

4) M. Fujimaki, N. Furuya, S. Saiki, T. Amo, Y. Imamichi and N. Hattori, “Iron supply via NCOA4-mediated ferritin degradation maintains mitochondrial functions”, Mol. Cell. Biol.., 2019,doi: 10.1128/MCB.00010-19.

5) K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem Biophys Res Commun.., 2019,doi: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.

6) Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264, doi: 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

7) KF. Yambire, C. Rostosky, T. Watanabe, D. Pacheu-Grau, S. Torres-Odio,A. Sanchez-Guerrero,O. Senderovich, EG. Meyron-Holtz,I.Milosevic, J. Frahm, AP. West and N. Raimundo, “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo.”, Elife, 2019, 3, (8), doi:10.7554/eLife.51031.

8) H. Nishizawa, M. Matsumoto, T. Shindo, D. Saigusa, H. Kato, K. Suzuki, M. Sato, Y. Ishii, H. Shimokawa and K. Igarashi, “Ferroptosis is controlled by the coordinated transcriptional regulation of glutathione and labile iron metabolism by the transcription factor BACH1″,  J. Biol. Chem.,  2019,doi: 10.1074/jbc.RA119.009548.

9)Y. akashima, A. Hayano and B. Yamanaka, Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells.”, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

性状：本品溶于乙腈、甲醇、二甲醇。

纯度（HPLC）：90.0%以上

荧光光谱：适合测试

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NO.3.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

NO.4.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

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铁是生物体内最重要的金属元素之一，生物体内铁元素的含量虽少，但有着重要的生理作用。近年来，随着铁死亡概念的提出，细胞内铁离子的代谢过程的研究逐渐成为了研究热点。同仁化学研究所开发的 Iron Assay Kit-Colorimetric-试剂盒 是一套操作简便的比色法铁离子检测试剂盒。与其他市面上的检测试剂盒 相比 ，可以在更短的时间内进行快速检测。通过比较组织裂解液中的铁离子探针 3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(5-sulfo-2-furyl)-1,2,4-triazine, disodium salt的 吸光度与还原成二价铁离子的三价铁标准品的吸光度，即可确定组织样品中的二价铁含量。同时，还可以通过试剂盒中的还原剂将样品中的三价铁还原成二价铁，以确定总铁含量，进而计算出样品中三价铁的含量。

组织样品中的Fe²⁺和 Fe³⁺的检测

1. 称量 100 mg肝脏组织 。

2. 加入 1 ml冷 PBS，移液器吹打 20次， Vortex振荡 10 s 14,000 RPM离心 4 min，去除上清 。

3. 将样品转移至研钵，加入液氮充分研磨成粉末后，加入 1.3 ml Assay Buffer，回收至微管中。

4. 将含有样品的微管置于超声波水浴中 5 min。（为防止样品温度上升，每 1 min间隔置于冰浴上 20 s）。

5. 16,000 g离心 10 min，除去不溶物。

6. 取 1300 μl上清液，每管分别加入 400 μl上清液，制成二价铁样品、总铁样品、样品空白。

7. Standard管 中加入 Reducer solution。 （参考图 2 H管 30 μl、 G~C管 20 μl、 B管 40 μl、 A管 20 μl）。

二价品样品管中加入 20 μl Assay Buffer。

总铁样品管中加入 20 μl Reducer solution。

样品空白管中加入 20 μl Assay Buffer。

将所有的 Standard管、样品管、样品空白管 37 培养 15 min。

8. 参考表 1和表 2，加入至 96孔板中 37 培养 60 min，检测 593 nm处的吸光度。

9. 将酶标仪数据拷贝至 “Iron Assay Kit – Excel表 ”，自动计算 出二价铁和三价铁浓度。

Hao Ren,et.cl，“Self-assembled FeS-based cascade bioreactor with enhanced tumor penetration and synergistic treatments to trigger robust cancer immunotherapy”，APSB，2020，DOI:10.1016/j.apsb.2021.05.005