炔烃修饰的寡核苷酸与染料叠氮化物的缀合
点击化学缓冲液适用于含有炔烃的寡核苷酸的合成后缀合。带有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亚磷酰胺合成，或者您也可以在我们的网站上订购修饰寡核苷酸的合成。
叠氮化物与修饰寡核苷酸的末端炔缀合，形成五元杂环。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。
该反应在铜 (I) 存在下、中性 pH 值下进行。催化缓冲液含有铜 (II)、醋酸三乙铵 pH 7 和 DMSO。建议使用新配制的 抗坏血酸溶液来还原铜 (II)。
对于此反应，您将需要炔烃修饰的寡核苷酸、叠氮化染料、点击化学缓冲液和抗坏血酸。您可以在我们的网站上在线订购所有试剂。
协议
我们推荐以下方案用于含炔寡核苷酸与叠氮化染料的缀合：
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根据要使用的寡核苷酸的量确定总反应体积：
寡核苷酸的量 总反应体积，μL 4至20纳摩尔 100 20至40纳摩尔 200 40至80纳摩尔 400 80 至 600 纳摩尔 600 -
使用下表计算标记反应的试剂体积：
试剂 体积，微升 原液浓度 叠氮化染料 (寡核苷酸量[nmol])×0.15 10 mM DMSO 溶液 点击化学缓冲液 （总反应体积[μL]）×0.67 1.5倍 活化剂
（抗坏血酸）（总反应体积[μL]）×0.02 50 mM 水中 水（用于溶解寡核苷酸） （总反应体积 [μL] – 叠氮化染料溶液的体积 [μL] – 缓冲液的体积 [μL] – 活化剂溶液的体积 [μL]） — -
准备叠氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化剂（抗坏血酸，水中 50 mM） 的储备溶液 。
请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液（该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。
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将寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 计算体积的 水中。
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添加点击化学缓冲液和涡旋。
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添加计算体积的叠 氮化染料储备溶液并再次涡旋。
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（受到推崇的）。将混合物脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气、氮气或氦气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流并将头部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将头部保持在该位置 10-20 秒。
如果同时运行多个标记反应，则可以使用 SpeedVac 型系统进行脱气。为此，将管子放入系统中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端注入惰性气体。
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添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。
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涡旋溶液。如果反应过程中形成沉淀，请将管在热水 (70–95 °C) 中加热，直至沉淀溶解并涡旋溶液。
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让混合物在室温下静置 8-16 小时。
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添加 2M 高氯酸锂溶液（每 5 体积的反应混合物 1 体积），涡旋溶液，并添加额外的纯丙酮至 2 mL。
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摇动管子并使其在-20°C 下静置 20 分钟。
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以 10,000 RPM 离心 10 分钟，分离沉淀物。丢弃上清液。
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将 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。摇动管数次，并以 10,000 RPM 离心 10 分钟分离沉淀物。丢弃上清液。
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让沉淀物在室温下在开口管中干燥 1 小时或将管放入 65°C 的加热块中 10 分钟。
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将沉淀物溶解于水中，并通过HPLC纯化目标产物