化学发光免疫分析（CLIA）技术的原理及应用

化学发光免疫分析法（CLIA）诞生于1977年，根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏度的化学发光技术与高特异性的免疫反应相结合而建立的化学发光免疫分析法。 CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简单、不需要非常昂贵的设备等特点。

化学发光免疫分析是高灵敏度化学发光分析技术与高特异性免疫反应的结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物的检测和分析。 。它是继放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的最新免疫分析技术。

CLIA的应用范围很广，不仅可以检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，还可以用于核酸探针的检测。与放射免疫分析（RIA）、荧光免疫分析（IFA）和酶免疫分析（EIA）相比，CLIA具有无辐射、标记物有效期长、全自动化等优点。 CLIA 为兽医、医学和食品分析测试和科学研究提供痕量或超痕量非同位素免疫分析。

一、化学发光免疫分析技术的基本原理

化学发光免疫分析包含免疫分析和化学发光分析两个系统。免疫分析系统采用化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体上，通过抗原与抗体反应形成抗原抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应后添加氧化剂或酶的发光底物。化学发光物质被氧化剂氧化后，形成处于激发态的中间体，该中间体发射光子释放能量回到稳定的基态。发光强度可以使用发光信号测量仪来检测。根据化学发光标记与发光强度的关系，可以使用标准曲线计算分析物的含量。

2. 化学发光免疫分析的类型

化学发光免疫分析根据标记物的不同可分为三类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。

2.1 化学发光免疫分析

化学发光免疫测定是一类用化学发光剂直接标记抗体或抗原的免疫测定。目前常见的标记物主要是鲁米诺和吖啶酯化学发光剂。

2.1.1 鲁米诺标记化学发光免疫分析

鲁米诺物质的发光是氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被多种氧化剂氧化，其中常用的是H2o2。由于发光反应速度慢，需要添加一些酶或无机催化剂。酶主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类有O3、卤素和Fe3、Cu2、Co2及其复合物。

早期主要用于无机和有机生物小分子的测定，因标记后发光强度下降而导致灵敏度降低。研究发现，在发光体系中添加一些酚类及其衍生物、胺类及其衍生物、苯基硼酸衍生物，可以显着增强体系的发光能力，发光强度可提高1000倍，“背景”发光明显降低，发光时间也延长。这些增强剂的使用使得化学发光免疫测定法能够广泛应用于蛋白质和核酸分析领域。

2.1.2吖啶酯标记的化学发光免疫分析：吖啶酯由于热稳定性差而用于CLIA，通过研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在H2o2和OH的条件下，吖啶酯类化合物可以快速发光，并且量子产率很高。例如吖啶芳基酯的量子产率可以达到0.05。采用吖啶酯作为免疫分析的标记物，发光系统简单。 、速度快、无需添加催化剂、标记效率高、背景低。这些特点引起了广大分析诊断工作者的极大兴趣。

2.2 化学发光酶联免疫分析

化学发光酶免疫分析（cLEIA）是酶免疫分析的一种，只不过酶促反应的底物是发光剂。然后酶作用于发光底物，在信号试剂的作用下发光，用发光信号分析仪进行发光测量。

常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们都有各自的发光底物。

常用的 HRP 发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA中，使用过氧化物酶标记的抗体，进行免疫反应后，以鲁米诺作为发光底物，鲁米诺在过氧化物酶和起始发光试剂（NaOH和H2o2）的作用下发光，酶免疫反应中酶的浓度该物质决定化学发光的强度。这种传统的化学发光体系（HRP-H2O2-LUMINOL）在几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、测量困难的缺点。后来在发光系统中添加了增强型发光剂，增强发光信号并保持较长时间的稳定，以利于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。

碱性磷酸酶（ALP）已广泛应用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。碱性磷酸酶和1,2。由二氧杂环丁烷组成的发光体系是目前化学发光体系中最重要、灵敏的一类。此类系统的代表是ALP-AMPPD发光系统。 AMPPD在溶液中的磷酸键非常稳定，非酶水解非常缓慢。在pH12的0.05mol/L碳酸钠缓冲溶液中，分解半衰期可达74年，且几乎不存在试剂本身的发光背景。 AMPPD是磷酸酶的直接发光底物，可用于检测碱性磷酸酶或抗体、核酸探针和其他配体的缀合物。 ALP-AMPPD发光系统具有非常高的灵敏度，标记物ALP的检出限达到10-21mol，是灵敏的免疫分析方法之一。对AMPPD进行改进，得到反应动力学更好、灵敏度更高的新一代产品：CSPD、CDP-Star。这些系统已广泛应用于各种基因和病原体DNA的鉴定。

2.3 电化学发光免疫分析

电化学发光（ECL）是指由电化学反应引起的化学发光过程。 ECL反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌[Ru(byp)2+3]，三丙胺(TPA)用于激发光反应。在阳极表面，两种物质同时失去电子。在电极板上，Ru(byp)2+3 被氧化为 Ru(byp)3+3，TPA 也被氧化为阳离子自由基（TPA+#），TPA+# 自发释放质子，成为不稳定分子（TPA * ） ，将电子传递给 Ru(byp)3+3，形成激发态 Ru(byp)2+3。 Ru(byp)3+3在衰变时发射出波长为620NM的光子，并返回到基态Ru(byp)2+3。这个过程在电极表面重复进行，产生高效稳定的连续发光，并不断增强。

ECL的突出优点是：

①标记物分子小，可实现多重标记，且标记物非常稳定；

②发光时间长、灵敏度高；

③光信号线性好，动态范围宽，超过6个数量级；

④ 可重复测量，重现性好；

⑤ 可实现多重检测和均相免疫分析；

⑥速度快，通常只需18分钟即可完成一个样品的分析；

⑦全自动化。电化学发光免疫分析由于其优越性，是一种很有前景的免疫分析方法，越来越受到人们的重视。它已广泛应用于抗原、半抗原和抗体的免疫检测。

3. 申请

化学发光免疫分析（CLIA）和发光酶免疫分析（CLEIA）是化学发光免疫分析中常用的两种免疫分析方法。底物是发光剂的基础。根据仪器的检测自动化程度，仪器可分为自动和半自动两种。目前国内临床市场的全自动产品大部分都是进口产品；根据分离技术，仪器分为磁珠分离和塑料孔板分离两种。

化学发光免疫分析技术在检验医学中有很多应用，包括肿瘤标志物、心脏标志物、甲状腺功能、胰岛素和C肽以及糖尿病、传染病、骨代谢、细胞因子、激素、生长激素系统、贫血诊断和鉴别诊断、过敏反应等和监测治疗药物浓度。