点击化学的应用——测定细胞增殖和 DNA 复制

点击化学的应用——测定细胞增殖和 DNA 复制

细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化,并且适合高通量筛选。

检测复制的 DNA 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (BrdU)核苷实现的,该核苷在复制过程中融入 DNA。然后,细胞 DNA 中的这些核苷修饰可以通过抗 BrdU 抗体检测到。尽管具有特异性,但这种测定方法繁琐且难以重现,因为需要用刺激性试剂处理细胞,以使 DNA 暴露于抗体,否则这些抗体不会穿透细胞结构。

一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (EdU),可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 DNA 后,该核苷可在铜 (I) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合,从而对复制的 DNA 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理(只需要用 Triton 进行透化),因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤(步骤 8)后,可以使用具有各种发射波长的荧光团(例如 Hoechst、DAPI 或荧光标记抗体)来标记细胞

所需试剂

  1. 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)

  2. Cu-TBTA 络合物— сlick сhemistry 催化剂

  3. 抗坏血酸— 铜的还原剂

  4. 叠氮化物荧光染料

  5. DMSO,标签级— 叠氮化物溶剂

  6. Triton X-100(或 Tween-20)

  7. PBS,pH 7.4

  8. 100 mM Tris 缓冲液,pH 7.4

确切的方案取决于特定的细胞或组织类型,但一般工作流程如下所述:

  1. 将细胞/组织与 10–20 μM EdU 孵育所需的时间。

  2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。

  3. 用 PBS 清洗细胞。

  4. 用含有 0.2% Triton X-100(或 0.5% Tween-20)的 PBS 透化细胞 30 分钟。

  5. 再次用 PBS 清洗细胞。

  6. 在 100 mM Tris 缓冲液,pH 7.4(对于磺化叠氮化物)或 100 mM Tris 缓冲液,pH 7.4,含有 50% DMSO(对于非-磺化叠氮化物)。该混合物应新鲜制备,因为铜 (I) 在水溶液中不稳定。

  7. 将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。

  8. 用 PBS 清洗细胞。

  9. (可选)如果细胞必须用不同的荧光团标记,请使用标准方案继续染色。

磺化(水溶性)叠氮化物,例如磺基氰叠氮化物和 AF 叠氮化物,可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物(例如氰叠氮化物或 BDP 叠氮化物)时,确保反应混合物中 DMSO 浓度为 50%。