Nancent蛋白质合成分析
HPG/AHA蛋白合成分析方案荧光显微镜
介绍
L-高炔丙基甘氨酸（HPG）和L-叠氮高丙氨酸（AHA）是传统35S蛋氨酸的非放射性替代品，后者在活性蛋白质合成过程中被并入蛋白质中，可以直接添加到细胞中。用于检测从头合成蛋白的基于HPG和AHA的商业试剂盒提供了很好的结果，但通常非常昂贵，并且提供了固定量的试剂，这限制了这些试剂盒的优化或非协议使用。自组装套件是商用套件的可行替代品，尤其是当所有组件都可从许多供应商处广泛获得时。试剂的量和点击反应条件在许多商业试剂盒之间非常相似，并且符合大量已发表的基于HPG和AHA的新合成蛋白质检测程序。使用所提供的方案，研究人员将能够组装HPG或AHA蛋白质合成测定，这将需要很少的微调（如果有的话）。
这些具有改进的生物相容性和检测极限的试剂盒首先由赛默飞世尔科学公司商业化，并以Click iT®HPG和Click i T®AHA的价格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代铜螯合叠氮化物。在叠氮化物报告分子处引入铜螯合部分允许显著增加反应位点处的有效Cu（I）浓度，增强了反应速率加速中的最弱环节，大大提高了用于分析细胞中蛋白质合成的基于HPG和AHA的测定的灵敏度和生物相容性。
所需材料
HPG（L-炔丙基甘氨酸）或AHA（L-氮杂高丙氨酸）
AZDye吡啶叠氮化物
五水合硫酸铜（II）
THPTA公司
抗坏血酸钠
固定剂（PBS中3.7%甲醛）
渗透试剂（例如，0.5%Triton®X-100 PBS溶液）
PBS中的3%BSA（pH 7.4）
Hoechst 33342（可选）
材料准备
HPG/AHA储备溶液制备50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液，例如使1 mL 50 mM储备溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中
AZDye Picolyl Azide储备溶液在DMSO或水中制备1mM溶液。示例：要制备150µL，将整个AZDye Picolyl Azide试剂盒溶于150µL DMSO或水中
铜催化剂（25 mM CuSO4，62.5 mM THPTA）溶液称出312 mg五水合硫酸铜（II）和1.35 g THPTA，加入50 mL水，涡旋至溶解
反应缓冲液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5。将3.02 g Tris，4.4 g NaCl溶于500 mL水中，调节pH至7.5，无菌过滤器
Hoechst 33342 10 mg/mL储备溶液。将1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去离子水中
还原剂将20 mg抗坏血酸钠溶于1.8 mL去离子水中。涡旋直至溶解。抗坏血酸钠溶液易被氧化。我们建议始终使用新鲜制备的抗坏血酸钠溶液
在PBS中洗涤缓冲液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g干燥die氮化钠。用于长期储存的无菌过滤器
1.用HPG/AHA标记细胞
该方案基于大量基于HPG和AHA的程序的出版物，用于分析与不同类型细胞一起使用的细胞中的肽合成。优化的HPG/AHA浓度为50μM，但可能需要根据给定的细胞类型进行调整。生长培养基、细胞密度、细胞类型变化和其他因素可能会影响标记。鼓励研究人员首先确定HPG试剂的最佳浓度以及每种细胞类型的标记时间。
将细胞以所需的密度放置在盖玻片上，并在额外处理前让其恢复过夜
在DMSO或水中制备50 mM HPG或AHA溶液
用PBS清洗细胞一次，加入无蛋氨酸培养基，并在37°C下孵育细胞30–60分钟，以耗尽蛋氨酸储备
将所需量的HPG或AHA添加到无L-蛋氨酸培养基中的细胞中，以达到最佳工作HPG/AHA浓度（50μM，如果未优化）
在培养的细胞中加入HPG或AHA时，避免以可能破坏正常细胞循环模式的方式干扰细胞
在适合细胞类型的条件下培养细胞所需的时间。不同的细胞类型可能需要不同的孵育期，以便用HPG或AHA进行最佳标记。作为起点，我们建议50μM HPG或AHA持续1小时
立即进行细胞固定和渗透
2.细胞固定和渗透
以下方案用于在PBS中使用3.7%甲醛的固定步骤，然后进行0.5%Triton®X-100渗透步骤。也可以使用使用其他固定/渗透试剂（如甲醇和皂苷）的方案。
将每个盖玻片转移到一个井中。为了方便加工，使用6孔板
代谢标记后，移除培养基，向每个含有盖玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室温下孵育15分钟
去除固定剂，用PBS中的1mL 3%BSA清洗每个孔中的细胞两次
取出洗涤液。向每个孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液，然后在室温下孵育20分钟
3.HPG/AHA检测
注：每个盖玻片使用500μL反应混合物。只要剩余的反应组分保持在相同的比例，可以使用较小的体积。
根据表1制备所需量的反应鸡尾酒。按表中所列顺序添加配料。在制备后15分钟内使用反应混合物。
表1
移除渗透缓冲液（步骤2.4）。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每个孔中的细胞两次。取出洗涤液。
向每个含有盖玻片的孔中加入0.5mL反应鸡尾酒。短暂摇动盘子，确保反应混合物均匀分布在盖玻片上。
避光，在室温下孵育板30分钟
取出反应混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗涤每个孔一次。取出洗涤液。
用1mL洗涤缓冲液洗涤每个孔一次。取出洗涤液。
用1mL PBS洗涤每个孔一次。取出洗涤液。
此时，样本已准备好进行DNA染色。如果不需要DNA染色，继续进行成像
如果需要对样品进行抗体标记，请按照制造商的建议进行标记。培养过程中，保持样品免受光照。
4.DNA染色
用1mL PBS清洗每个孔。取出洗涤液。
通过稀释Hoechst 33342 1:2000的储备溶液制备1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最终浓度为5µg/mL。
1x Hoechst 33342的最终浓度范围为2μg/mL至10μg/mL。
每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光线照射。在室温下孵育30分钟。
移除Hoechst 33342溶液。
用1mL PBS洗涤每个孔两次。
取出洗涤液。
成像
标记细胞与所有载玻片制备方法兼容
所选引用：
Dieterich，D.C.、Link，A.J.、Graumann，J.、Tirrell，D.A.和Schuman，E.M.等人（2006）。使用生物正交非经典氨基酸标记（BONCAT）选择性鉴定哺乳动物细胞中新合成的蛋白质。美国国家科学院院刊，103（25），9482-87。[PNAS]